胰腺癌是一种极为致命的恶性肿瘤，是全球范围内与癌症相关的死亡的第七大主要原因。胰腺癌的发病率逐年增加，在美国，五年总生存率在2019年仅为9％，在所有癌症类型中均是最差的。这种不良预后通常归因于晚期诊断，因为大多数患者患有无法切除的晚期疾病。由于早期发现可以大大改善患者的预后，因此迫切需要开发敏感的和特异性的生物标志物以进行早期发现。胰腺导管腺癌占胰腺癌的90％以上，据信是由非侵入性前体病变引起的。胰腺上皮内瘤变是PDAC最常见的非侵入性前体。PanIN是小胰管中的微观上皮肿瘤，表现出不同的细胞学和结构异型性。根据不典型增生的程度，PanIN分为三个等级：PanIN-1，PanIN-2和PanIN-3。PanINs表示之前PDAC发展一种可固化阶段，并且是早期检测的重要目标。
　　 microRNA是短的单链非编码RNA，在各种人类癌症中经常失调。miRNA主要通过结合靶信使RNA的3′非翻译区来调节转录后基因的表达。已经有miRNA被认为是癌基因和癌抑制基因，并有望成为非侵入性生物标志物候选物。小组报告说，miR-483-3p在PDAC的肿瘤组织和小部分PanIN病变中表达升高，并且与PDAC的预后相关。已报道在结肠直肠癌，乳腺癌和胰腺癌中miR-483-3p的上调。在胰腺癌，SMAD4已被鉴定为miR-483-3p的靶基因，在临床前模型中，miR-483-3p已被证明可促进胰腺癌中肿瘤细胞的增殖。
　　 外泌体是40–100nm大小的细胞外膜囊泡，可携带生物活性物质，例如脂质，蛋白质和核酸。几乎所有的哺乳动物细胞分泌的外来体，包括癌症细胞，其介导细胞-细胞通信。miRNA被认为是外来体进行枢转功能的分子。越来越多的证据表明，外泌体通过携带可影响肿瘤增殖，血管生成，能量代谢，转移前利基形成和传播的miRNA，在癌症生物学中发挥重要作用。最近的其他研究也表明，外泌体miRNA在液体活检中作为新型癌症生物标志物的潜在价值。在这项研究中，我们评估了循环miR-483-3p充当通过液体活检可识别的PDAC生物标记物的潜力。使用TaqManmicroRNA分析法对来自PDAC患者和健康对照组的血清和血清外来体样品中的循环miR-483-3p表达水平进行定量。此外，我们分析了来自PDAC患者的匹配的PDAC和PanIN病变组织标本中的miR-483-3p表达。证明miR-483-3p在PanIN和PDAC组织中过表达，并且在PDAC患者的血清和血清外泌体中均显着升高。研究结果表明，血清miR-483-3p的水平可作为早期检测PDAC的潜在液体活检生物标志物。还发现血清中的外泌体miR-483-3p水平可能是有用的PDAC预后生物标志物。
　　 根据赫尔辛基宣言对患者，组织样本和血清样本进行检查。该研究得到北京协和医院医学伦理委员会的批准。从PUMCH病理系的档案文件中检索总共107个连续的福尔马林固定，石蜡包埋的PDAC标本。所有病例均由两名病理学家独立检查，以确诊为PDAC。用显微镜对每个病例的多个苏木精-伊红染色的载玻片进行镜检，以查找与PDAC病灶相邻的PanIN病灶。PanIN病变根据WHO3级分级系统进行分类。总共鉴定出272个PanIN病变，其中包括117个PanIN-1、97个PanIN-2和58个PanIN-3。匹配的邻近非病理性胰腺可用于所有病例。在2013年至2017年的一段时间内，从107例收集组织的PDAC患者中接受手术切除，然后在PUMCH进行最初的非手术治疗。这些患者均收集了临床数据，并接受随访。从手术切除日期到死亡日期或最后一次随访日期计算总生存时间。使用美国癌症联合委员会第八版胰腺癌分期系统评估肿瘤分期。从石蜡块上切下未染色的5um切片，以进行进一步分析。2017年从63名PDAC患者以及22名健康对照中收集术前血清样品。所有血清样品均保存在-80°C下直至分析。所有研究参与者均提供知情同意。
　　 根据先前描述的方案，使用针对miR-483-3p的LNATM探针对档案PDAC和PanIN病变进行LNA-ISH。U6探针和加扰的LNA探针分别用作阳性和阴性对照。所有的探针在5′和3′末端都用洋地黄毒苷标记。简而言之，将载玻片脱蜡，用蛋白酶K消化，固定在4％多聚甲醛中，并用0.1M三乙醇胺处理。用PBS冲洗后，将玻片在没有探针的情况下在56°C下预杂交2小时，然后在含有洋地黄毒苷标记的LNATM杂交缓冲液中孵育探头在56°C下放置16小时。在杂交温度下用0.2×SSC严格洗涤后，将载玻片与封闭缓冲液一起孵育1小时，然后与抗洋地黄毒苷APFab片段在4°C下反应过夜。在黑暗中使用NBT/BCIP即用型片剂观察反应产物24小时。然后将载玻片用0.1％的牢牢红色染色，并使用封固剂封固。使用光学显微镜分析结果。ISH结果分为0，1弱或聚焦染色阳性或2强和弥散染色阳性。将未染色的组织切片去石蜡，然后在高压下于0.01M柠檬酸缓冲液中煮沸10分钟。然后将玻片用3％过氧化氢处理10分钟以灭活内源性过氧化物酶。与抗Smad4抗体在4°C孵育过夜后，将玻片洗涤并在室温下用HRP偶联的抗兔二抗标记1小时。然后用3，3′-二氨基联苯胺可视化染色。用兔血清代替抗Smad4抗体作为阴性对照。两名病理学家分别评估PanIN和PDAC病变的免疫染色，并获得所有病变的共识。根据先前研究中使用的标准，将幻灯片分为0，1或2。正常胰腺导管和腺泡担任每个滑动阳性内部控制。
　　 人胰腺癌细胞系AsPC1和PANC1最近是从ATCC购买的，因此未经此项工作的验证。培养条件包括补充有10％胎牛血清的DMEM培养基。根据制造商的说明，使用ExoQuick血清外泌体沉淀溶液从200uL的患者血清中提取外泌体。简而言之，将血清在冰上解冻，并以3000g离心15分钟以去除任何细胞或细胞碎片。将50uLExoQuick溶液添加到200uL血清样品中，并充分混合。将该混合物在4℃下保持过夜，然后在第二天以1500g离心30分钟。然后丢弃上清液，将外泌体悬浮在100uLPBS中进行分析。从200uL血清或外泌体中提取总RNA。变性后，将25个fmol合成miRNA刺入对照添加到每个样品中，以标准化在miRNA提取和随后的定量反应过程中可能产生的样品之间的差异。使用NanoDropND-1000分光光度计检查提取的RNA，以评估RNA的纯度和浓度。
　　 使用TaqManMicroRNA分析通过定量实时PCR评估血清和血清外来体样品中的miRNA水平。首先，按照制造商的说明，使用TaqMan反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA。然后按照以下循环条件在ABI7500实时PCR系统上进行定量PCR：50°C2分钟，然后95°C10分钟，然后进行40个95°循环C在15秒钟和60°C在1分钟的时间。使用2-ΔΔCt方法确定miR-483-3p的相对表达水平。将miRNA刺入用作标准化对照。每个样品进行三次重复测定。按照制造商的说明，通过Lipofectamine2000试剂，用hsa-miR-483-3p模拟物或带有阴性对照的抑制剂转染细胞。细胞迁移和侵袭测定是在6.5mm的小室中进行的，该小室具有8.0um的孔，可涂有或未涂有Matrigel。转染后二十四小时，将细胞添加到上腔室中，并将600uL生长培养基添加到下腔室中。将细胞温育24小时，然后用4％PFA固定并用0.1％结晶紫染色。计数迁移到膜下腔的细胞。
　　 使用Pearson卡方检验或Fisher精确检验比较PDAC和PanIN病变中miR-483-3p或Smad4表达的频率。调整P值以进行多次比较。进行Mann-WhitneyU检验以比较两组之间的血清和外泌体miR-483-3p水平。根据PDAC患者的血清中位数或外泌体miR-483-3p表达水平将其分为“低水平”和“高水平”组。使用皮尔逊卡方检验或费舍尔精确检验分析了临床病理参数与血清外泌体miR-483-3p水平之间的相关性。生成接收器工作特征曲线，并计算ROC曲线下的面积以评估血清外泌体miR-483-3p水平的诊断潜力。进行Kaplan-Meier分析和对数秩检验，以比较患者的总体生存率。使用Cox比例风险回归分析来评估多种风险因素与生存时间之间的关联，并确定预后预测因素。使用SPSSStatistics21.0，GraphPadPrism7.0和Excel进行统计分析。所有测试均为两尾检验，P<0.05被认为具有统计学意义。
　　 使用LNA-ISH分析107例PDAC患者的福尔马林固定的，PanIN和PDAC病变的石蜡包埋组织切片中的miR-483-3p表达。总共在107例PDAC病例中鉴定了272种不同组织学等级的PanIN病变。miR-483-3p在PanIN-1的64.1％，PanIN-2的84.5％和PanIN-3损伤的96.6％和100％但是，它在正常的胰管中没有表达。miR-483-3p阳性病灶的百分比在PANIN-2显著更高，泛印-3和PDAC病变相比PANIN-1损伤。的miR-483-3p阳性病灶的百分比也是在PDAC病变比帕宁-2病变。在107例病例中的32例中，观察到miR-483-3p染色强度显着的分级增加，与从正常导管到PanINs到PDAC的组织学变化相对应。LNA-ISH结果表明miR-483-3p的异常表达与PDAC的发展有关。miR-483-3p的表达早在PanIN-1阶段就被上调，并且在PanIN-2/3病变和PDAC中表达频率逐渐升高。在上皮细胞和相邻的基质成纤维细胞中均观察到miR-483-3p的过表达。
　　 先前的研究表明，SMAD4是胰腺癌和其他细胞类型中miR-483-3p的靶基因。从上述档案组织进行的Smad4的免疫组织化学染色对连续切片。在所有107例病例中，正常的胰腺组织均显示出Smad4的强细胞质染色模式。Smad4在PanIN-1的99.1％，PanIN-2的97.8％和PanIN-3损伤中的73.7％中表达。相反，PDAC病变中有53.3％完全失去了Smad4表达。与PanIN-3和PDAC病变相比，PanIN-1/2病变中Smad4阳性病变的百分比显着更高。miR-483-3p和Smad4表达在PDAC组织和邻近的PanIN病变以及正常的胰管中是互斥的。在107名PDAC患者中，PanIN和PDAC病变中miR-483-3p和Smad4蛋白表达呈负相关，这支持miR-483-3p表达的结论。在PDAC的发展过程中可能会抑制Smad4。据报道，miR-483-3p可以在体外促进胰腺癌细胞的增殖和集落的形成。进一步研究的miR-483-3p对胰腺癌细胞迁移和侵袭的影响。用miR-483-3p抑制剂和对照miRNA转染胰腺癌细胞系Panc-1。还用miR-483-3p模拟和阴性对照miRNA转染胰腺癌细胞系AsPC1。在Panc-1细胞中，相对于阴性对照miRNA，miR-483-3p抑制剂在体外Transwell分析中显着抑制细胞迁移和侵袭。在AsPC1细胞中，与阴性对照miRNA相比，miR-483-3p模拟物在相似的测定法中显着增加细胞迁移和侵袭。
　　 接下来检查63名PDAC患者和22名健康对照者血清样品中循环miR-483-3p的表达。使用RT-qPCR对外泌体和血清中的miR-483-3p水平进行了评估。与健康受试者相比，PDAC患者的血清和外泌体miR-483-3p水平显着更高。有趣的是，PDAC患者的血清和外泌体miR-483-3p水平无关。然后，我们使用ROC曲线评估miR-483-3p在PDAC中的诊断潜力。血清miR-483-3p水平可使ROC曲线面积为0.81的PDAC患者与健康受试者区分开。敏感性和特异性分别为74.6％和77.3％，临界值为1.2839。重要的是，血清miR-483-3p还可以将ADAC为0.83的PDAC患者与较小的肿瘤与健康对照区分开，敏感性和特异性分别为85.7％和72.7％，截止值分别为1.0722。当将I期PDAC与健康对照区分开来时，血清miR-483-3p的AUC为0.79。截断值为1.0722，敏感性和特异性分别为72.2％和72.7％。当将PDAC患者与健康对照区分开来时，外泌体miR-483-3p的AUC为0.69，这表明血清miR-483-3p的诊断价值高于正常人。外泌体miR-483-3p水平。但是，与血清miR-483-3p相比，将血清miR-483-3p水平与外泌体miR-483-3p水平相结合可稍微提高诊断能力，AUC为0.84如果仅将其水平降低，则该组合并不能提高识别PDAC患者的敏感性或特异性。将血清miR-483-3p与CA19-9的诊断性能进行了比较。在ROC曲线分析中，CA19–9产生的AUC值为0.87，以区分PDAC和健康对照。敏感性和特异性分别为76.2％和100％。血清miRNA-483-3p的AUC值以及血清和外泌体miRNA-483-3p的组合略低于CA19–9的AUC值。CA19–9和血清miRNA-483-3p的结合水平产生的AUC值为0.94，灵敏度为82.5％，特异性为95.5％，在鉴定PDAC方面表现出良好的性能。
　　 然后进行相关分析，以了解循环miR-483-3p水平与PDAC中临床病理结果之间的关系。根据中位血清或外泌体miR-483-3p水平，将63例PDAC患者分为两组。我们发现高的外泌体miR-483-3p水平与较差的肿瘤分化，较高的N期和较高的总体分期显着相关。PDAC分化不良的患者与PDAC分化良好的患者相比，其外泌体miR-483-3p水平更高。但在肿瘤大小，T分期，年龄，性别和外泌体miR-483-3p表达之间未发现显着相关性。血清miR-483-3p水平也不与任何临床病理特征显着相关。为了确定循环miR-483-3p水平是否可以预测胰腺切除术后的患者预后，进行Kaplan–Meier生存分析。高水平miR-483-3p患者的总生存与低的患者相比。相反，血清miR-483-3p水平与患者预后无关。单因素Cox回归分析显示，较差的生存结果与肿瘤大小，总体分期和高的外泌体miR-483-3p水平显着相关。此外，多变量Cox分析表明，高外泌体miR-483-3p水平是PDAC患者的独立预后指标。
　　 在过去的三十年中，PDAC患者的生存率已显示出最小的改善。一个重要的限制因素是，大多数患者在PDAC发展的早期都无症状或具有非特异性症状。鉴定参与胰腺癌发病早期阶段的分子可能有助于开发诊断和预后液体活检生物标志物，从而改善胰腺癌患者的预后。在这项研究中，表明miR-483-3p在非侵袭性PanIN病变以及侵袭性PDAC中经常过表达，但在几乎所有正常的胰腺导管上皮中均不存在其表达。miR-483-3p的过表达最早出现在PanIN-1病变阶段。先前在胰腺癌前体报道的其他失调的miRNA表现出与miR-483-3p表达相似的模式，随着PanINs的组织学非典型性增加而逐渐增加，而假定的miR-483-3p目标基因SMAD4蛋白表达则逐渐丢失的。PanIN是经过充分研究的PDAC的非侵入性前体。尽管大多数PDAC病变源自PanIN，但由于其微观尺寸，因此尚无有效的方法来检测这些病变。我们先前曾报道，与正常胰腺组织相比，miR-483-3p表达在PDAC组织以及一小部分PanIN病变中差异上调。这项研究证实在大量独立病例中的早期发现，我们再次发现PanIN病变中miR-483-3p表达增加。这些数据加在一起表明，miR-483-3p过表达是PDAC肿瘤发生中的早期事件，这可能是早期，可识别的胰腺癌生物标志物。
　　 在过去的十年中，已经做出巨大的努力来研究循环miRNA在多种癌症中的表达模式。循环中的miRNA也已成为液体活检领域的重点，因为无细胞的miRNA在包括血液在内的各种生物流体中都非常稳定。在血液中，循环的miRNA被封装在细胞外囊泡中，或者与蛋白质复合物结合在一起。大多数研究都集中在循环中的总无细胞miRNA上，而不是外泌体miRNA，但最近的研究表明，大多数循环中的miRNA都集中在外泌体上。我们发现在PDAC患者的血清和血清外泌体中可检测到miR-483-3p。与健康对照组相比，PDAC患者的血清和循环外来体样本中的miR-483-3p水平均显着升高。相比之下，与外泌体相比，血清样品在miR-483-3p水平上的增加更大，具有更好的AUC值，可以帮助将PDAC患者与健康受试者区分开。还发现PDAC肿瘤组织中miR-483-3p的过表达在肿瘤切除后循环中减少，这表明循环中的miR-483-3p可能起源于PDAC癌细胞。
　　 相对于循环外泌体miR-483-3p，血清miR-483-3p水平显示出对PDAC更好的诊断价值，这是因为相对较高的AUC值为0.81。ROC曲线中的血清miR-483-3p的AUC值与常规使用的PDAC肿瘤标志物CA19-9相当。血清和外泌体miR-483-3p水平的组合将AUC值提高到0.84。早期PDAC中的血清miR-483-3p水平可用于将这些患者与健康受试者区分开，AUC值为0.83。因此，循环的miR-483-3p有潜力用作PDAC的早期诊断的非侵入性液体生物标记。虽然血清miR-483-3p水平可以作为PDAC的诊断标志物，但高核糖体miR-483-3p表达与PDAC组织学评分升高，N期高分期和整体临床晚期分期显着相关。这些关系可能表明外泌体miR-483-3p表达是PDAC发病机理的一部分，而与高N期的关系可能表明miR-483-3p有助于PDAC的转移潜力。但是，与先前的研究一致，我们观察到血清miR-483-3p表达与任何临床病理特征均不相关。
　　 此外研究表明，血清外泌体miR-483-3p水平可作为PDAC的预后生物标志物，因为Kaplan–Meier分析显示，血清中外泌体miR-483-3p的高水平与PDAC患者的生存率显着降低有关。多变量Cox回归分析还显示，血清中高的外泌体miR-483-3p水平是PDAC患者的独立预后因素。miR-483-3p已显示出通过靶向SMAD4来促进胰腺癌细胞中的细胞增殖和集落形成，SMAD4是胰腺癌发病机制中的关键肿瘤抑制基因。在这项研究中发现miR-483-3p表达与PDAC组织样品中的Smad4蛋白表达呈负相关，与先前的报道一致。在PanIN病变中也发现了这种反相关。这些观察结果表明，miR-483-3p可能通过下调SMAD4在PDAC的早期发病机制中发挥致癌作用。我们的血清外泌体miR-483-3p水平与N期显着相关的观察使假设miR-483-3p可能影响胰腺肿瘤细胞的迁移和侵袭能力。在体外进行测试，发现miR-483-3p在transwell分析中促进细胞迁移和侵袭。这些发现与假定的miR-483-3p目标SMAD4的已知功能一致的，并进一步建议的miR-483-3p可能在PDAC进展中起关键作用。
　　 研究有两个局限性。首先，没有纳入慢性胰腺炎患者的血清样本。CP是PDAC的重要鉴别诊断，与PDAC具有相似的临床表现。其次，在我们的研究中样本量相对较小。总之，发现异常的miR-483-3p过表达发生在癌前PanIN病变的早期。还提供了证据，血清miR-483-3p是早期检测PDAC的潜在液体活检标记，血清外泌体miR-483-3p可以潜在地用作PDAC患者生存的预后指标。需要进行大规模的前瞻性多中心研究，以进一步验证循环的miR-483-3p作为PDAC生物标志物的潜力。