作为最严重的恶性肿瘤之一，胰腺癌的5年生存率不到6％。PC治疗的最大障碍是，绝大多数患者在疾病达到晚期之前都没有任何症状。尽管基于吉西他滨的疗法自1997年以来就已被确立为晚期PC的标准疗法，但这些疗法的毒性和获得性耐药性仍需进一步研究，以便可以开发出更具针对性的疗法。在过去的几十年中，一个有前途的研究领域集中在鉴定某些分子靶标，例如EGFR，K-Ras，B-Raf，PI3K/Akt和TGF-B，它们有望在临床上产生临床益处。EGFR也称为ErbB-1，就是这样一种靶标，已经引起学术界的广泛关注。作为受体酪氨酸激酶的成员，EGFR被广泛认为是多种实体瘤中的关键癌蛋白。现有研究表明，在所有PC患者中，有30％到50％的患者EGFR表达过高。EGFR的过表达与其他临床观察结果之间也存在相关性，例如疾病的快速发展，对化学疗法的抵抗力和不良的预后。
　　 此外据报道，EGFR途径在多种PC细胞系中经常被组成性激活，吉非替尼和厄洛替尼是两种EGFR抑制剂，可有效阻止其增殖。越来越多的证据似乎表明，基于EGFR的疗法有望作为治疗PC的有效方法。然而，令人沮丧的结果已在这类治疗与传统的化疗，违背现有期望的临床试验获得的。要了解基本的临床表现的机制，研究人员已经沿着这条线的研究仍在继续，找到有效地应用EGFR靶向疗法的临床实践中可行的办法的希望。发现EGFR抑制和Rb去磷酸化的组合导致PC细胞系的协同生长抑制。此外报道了人参皂苷Rg3通过抑制EGFR/PI3K/Akt途径信号传导使PC细胞对EGFR抑制剂厄洛替尼致敏。这些研究中的许多都集中在寻找解决PC细胞埃洛替尼耐药性的可能方法。然而，关于如何增强PC细胞中Gefi功效的工作还很少。
　　 已显示具有抗增殖和促凋亡作用的一种有前途的药物是伯巴明。BBM是一种天然的联苄异喹啉类生物碱从中国药用植物中提取檗山葡萄。它已被广泛用于中医药，以治疗各种疾病，包括自身免疫性疾病，炎症和癌症。许多研究表明，BBM对不同类型的癌症具有抗增殖和促凋亡作用，包括慢性粒细胞性白血病，肺癌，肝癌和乳腺癌。已经报道BBM的抗肿瘤机制/钙调蛋白依赖性蛋白激酶IIγ，bcr/abl和NF-κB信号通路的激活。最近，许多研究人员已发现，BBM也显示在反向多药耐药性意想不到的活性，并确定一些底层机制。BBM通过促进MDA-MB-231细胞凋亡，与塞来昔布和曲古抑菌素A发挥协同作用。此外，BBM通过调节TGF-B/Smad信号通路改善吉西他滨抑制细胞活力和诱导细胞凋亡的作用。因此，有力的证据表明，BBM可以多种方式有效逆转化疗耐药性。然而，尚无研究检查BBM在使PC细胞对EGFRTKIGefi等靶向治疗敏感的潜力和机制。本研究旨在探讨BBM和Gefi对两种耐Gefi的PC细胞Panc-1和Miapaca-2的协同作用。结果表明，BBM显着提高Panc-1和Miapaca-2细胞的Gefi敏感性。此外，蛋白质印迹和SPR分析结果表明，BBM可能通过直接与STAT3相互作用来协同抑制STAT3信号，从而使PC细胞系对Gefi敏感。计算机模拟进一步显示，BBM与STAT3SH2结构域形成几个关键的疏水相互作用，这可能主导BBM的STAT3抑制活性。
　　 人胰腺癌细胞系Panc-1，Miapaca-2获自美国典型培养物保藏中心。将细胞在补充有10％胎牛血清和100单位/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养。经过这些处理，将细胞保存在5％CO2的房间中并在37°C恒温。CellSignalingTechnology提供一些主要抗体，例如Bcl-2，Cdk4，Cdk6，Cleaved-caspase-3，Cleaved-PARP，cyclinD1，Akt，Erk，p-Akt，p-Erk，p-STAT3，STAT3和B-肌动蛋白。其他三个分子包括山羊抗兔IgG-HRP二抗，全长重组STAT3蛋白以及吉非替尼和贝巴明，它们是从SantaCruzBiotechnology，Abcam和Selleck购买的。SDSPAGE测定的全长重组STAT3蛋白的纯度超过85％，而吉非替尼和贝巴明的纯度均超过99％。
　　 细胞滴度96水性非放射性细胞增殖测定试剂盒用于测量不同细胞之间的变异性。首先，将5×103个细胞接种在96孔板中整夜。此后，除去培养基，并用不同浓度的化学物质处理细胞2天。在490nm下，使用酶标仪读取每个细胞的吸光度值。每个实验步骤重复三次。将Panc-1或Miapaca-2细胞包埋在六孔板中整夜。然后，在培养基中添加BBM，DMSO，Gefi和Gefi加BBM。将所得的培养基保存24小时，直到被新鲜的培养基替代为止，新鲜的培养基持续7-10天。在该间隔之后，使用PBS洗涤新鲜培养基1/4小时，然后通过结晶紫染色测定计数存活的菌落的数量并照相。流式细胞仪分析和蛋白质印迹是检测细胞凋亡的两种方法。对于第一种方法，首先将细胞处理2天。然后用胰蛋白酶收集它们，并用PBS洗涤两次。之后，将其重悬于100uL1x结合缓冲液中。然后向细胞悬液中添加5uLFITCAnnexinV和PI，然后在室温下孵育1/4小时。使用uL结合缓冲液稀释细胞后，使用ACSCalibur流式细胞仪对样品进行分析。对于第二种方法，分析Cleaved-PARP，Bcl-2和Bax。
　　 将细胞接种在六孔板中并培养过夜。用不同的化合物处理48小时后，使用胰蛋白酶消化收集它们，并通过离心沉淀。然后，使用PBS洗涤两次，将沉淀浸入4°C的75％冰冷的乙醇中过夜。离心后，使用冷PBS洗涤沉淀，然后将其重悬于含有50ug/mL碘化丙啶的500uLPBS中，并在室温下于黑暗中孵育1/2小时。最后，使用FACSCalibur仪器对样品进行分析。用所示化合物处理细胞24小时后，分别使用PBS和放射免疫沉淀测定缓冲液洗涤和裂解细胞。BCA蛋白测定试剂盒也用于定量细胞裂解液。SDS-PAGE将蛋白质分成相等的比例，然后电转移到0.22um的聚偏二氟乙烯膜上。首先在TBST中使用5％脱脂牛奶将膜封闭90分钟。然后将它们与特异性一抗在4°C下孵育一整夜。辣根过氧化物酶用于在室温下缀合二级抗体2小时。最后，增强化学发光的功能.
　　 在ProteonXPR36蛋白相互作用阵列将1mg/mLPBST的STAT3溶液稀释至30ug/mL。芯片通过EDC/NHS激活。然后，加载STAT3并共价固定。芯片上固定大约8000RUSTAT3。通过流动PBS溶液除去任何过量的未结合蛋白。制备并注入SchA的PBS溶液。以30/min的流速同时注入五种浓度为120s的缔合相，然后在25°C下注入解离相120s。最终图表是通过从双工或四重传感器图中减去空白感测图而获得的。ProteOnManager软件用于数据分析。
　　 AutoDock4.2软件用于执行STAT3和BBM的对接。蛋白质数据库贡献STAT3的起始蛋白质结构。先前的研究表明，STAT3的SH2结构域可被视为结合口袋。然后，在所获得的结构的某些缺少的元素加入，包括正规键序，收费，氢原子和一些残余物。此后，使用网格盒覆盖STAT3的活性结合表面。Lamarckian遗传算法也被用于进行构象采样，并进行100个对接的试验。选择具有最佳对接得分的预测构象用于进一步的分子动力学模拟分析。使用Amber18软件对STAT3/BBM复合物进行MD模拟。具体地说，HF/6-31G是由高斯09程序实施的，目的是测量BBM的静电势。然后，使用RESP拟合方法将这些电势拟合为BBM的原子部分电荷。为了优化分子力学，将ff14SB和gaff2的力场分别用于STAT3和BBM来创建MD参数。此后，将复合物浸入Tip3P槽中，蛋白质表面与槽边界之间的距离为15mm。并且添加了抗衡离子以中和该系统。使用最速下降法和共轭梯度法将受约束和不受约束的复合材料最小化。最小化后将体系从0加热到300K中为200ps，而在溶质弱约束为5千卡摩尔埃。然后，在200ps上进行等温等静压集成MD仿真，以调整溶剂密度。在300K时执行另外200ps的无约束MD仿真，以不受NPT限制地展开系统。最后，在系统上进行了200ns的自由MD仿真。Langevin温度标度用于调节温度。为了约束涉及氢原子的键，采用SHAKE算法。对于范围有限的非键合相互作用，使用粒子网格Ewald算法来调整周期性边界条件和静电相互作用。使用Amber18中的分子力学/广义生表面积方法评估结合自由能的分解，并从160到200ns的平衡轨迹中总共提取500张快照。该等式的详细说明已在以前报道过。结果表示为平均值±平均值的标准误差。在GraphPadPro中进行单向方差分析，以测试组之间的显着差异。“ns”表示没有意义。AP值低于0.01表示差异具有统计学意义。所有实验重复至少三遍。
　　 在以前的研究中，已经在一组人类PC细胞系中仔细检查Gefi的抗增殖活性，结果显示Panc-1和Miapaca-2对Gefi具有天然抗性。这些结果为我们在本研究中选择这两种细胞系提供理论依据。首先，进行MTS比色测定，以鉴定BBM对Panc-1和Miapaca-2细胞的抗增殖活性。IC50BBM针对PANC-1和的MiaPaCa-2值分别为8.137和11.16微米。基于IC50如果将BBM的值设置为5uM，则对Panc-1和Miapaca-2细胞的细胞毒性应很小。对于Gefi，Panc-1和Miapaca-2细胞的IC50值分别为25.57和22.79uM。接下来，进一步研究BBM和Gefi的敏化作用。结合Gefi和BBM的处理显着降低了Panc-1和Miapaca-2细胞的生存力，表明这种处理比单独的任何一种处理更有效。关于Panc-1和Miapaca-2细胞对Gefi的敏感性，IC50值表明，与单独使用Gefi处理的组相比，联合使用Gefi和BBM处理的组中的Panc-1和Miapaca-2细胞的敏感性分别提高了约2.3倍和2.46倍。为了进一步测试长期使用Gefi和BBM结合的治疗是否会产生更有效的抗生长作用，我们进行菌落形成试验。将细胞集落差异处理7-10天后，将它们用结晶紫染色并拍照。结果表明，与仅用一种化合物治疗的组相比，接受联合治疗的组的菌落形成协同减少。该结果与使用MTS测定获得的结果一致。
　　 为了探测细胞周期阻滞是否与BBM的致敏有关，利用流式细胞仪分析了细胞分裂每个阶段的细胞百分比。结果表明，Gefi和BBM的组合可以有效抑制G0/G1期的两种PC细胞系。另外，进行蛋白质印迹以验证引起G1期阻断的分子事件。结果表明，BBM的协同作用增强了Gefi对细胞周期相关蛋白表达的抑制作用。这些结果表明，BBM通过减少细胞周期相关蛋白的表达而与Gefi协同作用，从而抑制G0/G1期的细胞。为了研究Gefi和BBM对细胞凋亡的协同作用，使用单药治疗或联合治疗来治疗Panc-1和Miapaca-2细胞，并用AnnexinV-FITC和PI进行双重染色以确定流式细胞仪检测其凋亡率。Gefi和BBM联合处理后，PC细胞的凋亡率显着增加。为了阐明增强BBM诱导的细胞凋亡的分子机制，进行蛋白质印迹分析细胞凋亡相关蛋白Cleaved-PARP，Bax和Bcl-2的表达水平。结果显示，在接受联合治疗的组中，促凋亡分子的表达显着上调，而抗凋亡蛋白Bcl-2则下调。
　　 转录因子信号转导子和转录激活子3是下游分子，参与许多跨膜生长因子受体，胞质激酶和Janus激酶的信号转导。大量研究致力于阐明STAT3在多种癌症类型中的功能。这些研究通常表明，STAT3在各种血液学和实体瘤恶性肿瘤的发病机理中起关键作用。此外，最近的一些研究表明，包括STAT3，PI3K/Akt和ERK在内的EGFR下游途径的重新激活与对EGFR抑制剂产生抗性密切相关。所以，据推测，BBM的致敏作用可能是由至少一种这种信号传导途径介导的。进行了蛋白质印迹分析，以确定用BBM，Gefi或BBM加Gefi处理的Miapaca-2细胞中STAT3，Akt和ERK1/2的磷酸化和总蛋白表达水平。结果证明Gefi处理对Miapaca-2细胞中p-STAT3，p-Akt和p-ERK1/2的水平影响最小。这一发现与先前关于NSCLC细胞的许多报道相反，此外，在治疗中结合BBM和Gefi可有效下调STAT3Tyr-705的磷酸化，但对p-AktSer473和p-Erk1/2Thr202/Tyr204没有抑制作用。因此，这些结果提供一些证据，表明BBM协同作用的潜在机制可能是通过抑制STAT3信号激活来介导的。
　　 接下来，为了证实BBM对STAT3信号的抑制作用，通过蛋白质印迹法测定p-STAT3的水平。由于白介素6是在许多癌症中诱导酪氨酸Tyr705上的STAT3磷酸化的常见刺激物，因此我们研究了BBM对Miapaca-2中IL-6诱导的STAT3磷酸化的影响。即使在低至5uM的浓度下，BBM也以剂量依赖的方式抑制IL-6诱导的p-STAT3。此外，为了研究BBM是否可以直接结合STAT3，进行SPR实验。STAT3与BBM的结合亲和力随浓度水平的增加而增加，计算出的低平衡解离常数为12.1uM。综上所述，以上结果表明STAT3可能是BBM的直接靶标，并且BBM的Gefi敏化作用主要是由其对STAT3的抑制介导的。
　　 为了预测STAT3和BBM之间可能的结合模式，首先进行分子对接实验。然后，进行200ns的MD模拟，以获得一系列平衡且稳定的结构。以确认该模拟复杂达到平衡并调查STAT3/BBM的动态稳定性复杂所有的主链原子的，根均方偏差STAT3和BBM的重原子的监测。经过50ns的模拟后，STAT3的主链原子的RMSD显示出动态波动。BBMC的RMSDsα整个MD模拟过程中相对稳定。主成分分析是一种通常用于减少数据维数并确定MD模拟过程中蛋白质/分子所占据的构象空间的方法。在这项研究中，输入数据是来自MD仿真轨迹的笛卡尔坐标。也就是说，主成分代表坐标空间的方差。当PC相互绘制时，相似的结构会聚在一起。PCA结果表明，STAT3的构象空间是动态分布的，并且大多数结构都显示出高度的相似性。散点图还表明，这些图是相互靠近绘制的。观察结果表明，通过200nsMD模拟确定相对稳定的STAT3/BBM复合物结合构象。随后，使用MD模拟的最后40ns轨迹执行无残留能量分解。贡献最多的五个残基是Glu-594，Glu-638，Ser-636，Gln-635，Ile-634。主要残基是亲水性氨基酸，表明极性相互作用可能有助于BBM与STAT3的结合。嵌入在STAT3的SH2字段中的BBM似乎非常匹配，以将绑定袋实现为锁和钥匙。此外，静电分子的势能表面清楚地显示结合带负电荷的信息，这与BSTAT与STAT3结合的每个残基的自由能分解结果一致。结构分析表明，大多数相互作用是氢键，以稳定BBM和STAT3之间的构象。
　　 在过去的十年中，免疫疗法的飞速发展，再加上FDA批准的靶向疗法的增多，在乳腺癌，NSCLC，黑色素瘤和其他肿瘤的整体临床预后方面取得了巨大进展。相反，PC治疗似乎落后。几十年来，研究人员一直在努力寻找切实可行和可持续的目标，但只有EGFR抑制剂埃洛替尼已被FDA批准与吉西他滨联用。但是，该程序的第三阶段的结果证明是不令人满意的。与单独使用吉西他滨的治疗相比，联合治疗在DFS和OS方面几乎没有改善。吉非替尼是EGFR抑制剂的另一个首个代表，已广泛用于具有EGFR敏感突变的患者。在一些临床前研究中，Gefi还被证明对PC细胞具有良好的抑制作用。然而，Gefi的敏感性在不同的PC细胞系之间差异很大，这可能是临床疗效差的原因之一。CfPac1和BxPC-3细胞对Gefi高度敏感，而Panc-1和Miapaca-2细胞对Gefi高度不敏感。因此，找到一种克服Panc-1和Miapaca-2细胞对Gefi的天然抗性的有效敏化剂可能是提高Gefi临床疗效的有前途的方法。
　　 越来越多的证据表明，许多天然产物不仅抑制癌细胞的生长，而且有效地逆转了肿瘤的抵抗力。据报道，从植物中提取的五环丁烷型三萜烯-贝特林酸可以逆转PC细胞中癌细胞对吉西他滨的耐药性，并增强非小细胞肺癌细胞对索拉非尼的敏感性。因此，在这项研究中，专门研究另一种安全有效的抗癌天然产物贝巴明，并研究了它是否可以增强Gefi对耐药细胞的敏感性。尽管已经对BBM的化学致敏性进行一些研究，但尚未研究BBM对Gefi耐药性或其他靶向疗法的影响。发现与BBM联合治疗显着增强Gefi在Panc-1和Miapaca-2细胞中的抗增殖，细胞周期停滞和促凋亡作用。此外，尽管一些研究表明，BBM在体外对人肺癌，肝癌和胰腺癌细胞具有显着的抗增殖活性，但其抗肿瘤机制仍然难以捉摸。蛋白质印迹和SPR分析结果提供证据，表明BBM是一种潜在的STAT3抑制剂。通过测量单药或联合治疗后STAT3信号的作用，进一步证实BBM的抗PC活性和协同作用主要是由STAT3信号的抑制介导的。
　　 自2003年以来，FDA已批准吉非替尼用于转移性或晚期非小细胞肺癌患者。表皮生长因子受体靶向治疗已在临床实践中应用近16年。在应用中，一直存在的问题是其耐药性。由于许多研究人员的工作，已经发现许多抵抗机制。通常，EGFR第二位点突变，旁路信号通路补偿和EGFR下游信号重新激活被认为是产生耐药性的最重要因素。近年来，STAT3在这一过程中的重要作用尤其引起人们的广泛关注。作为细胞存活和增殖的关键转录因子，STAT3可以在Tyr-705中被磷酸化，随后被各种受体酪氨酸激酶，与受体相关的激酶如JAK和非受体激酶。这意味着可以通过上游信号阻断来控制狡猾的癌细胞，并选择激活STAT3的另一种方法。此外，许多研究表明靶向STAT3可能是治疗PC的一种有前途的方法。但是，尚无STAT3抑制剂被批准用于临床。当前，已经鉴定出大量的STAT3。但提高这些分子的制药能力仍然是一个很大的难题。在中国BBM已被用于伊马替尼诱导的中性粒细胞减少和炎症患者的临床治疗。BBM的安全性和抗肿瘤作用也已在临床实践中得到验证，这将为吉非替尼和BBM的联合治疗的快速发展提供极大的便利。
　　 众所周知的STAT3抑制剂，例如OPB-31121，TTI-101和S31-201，已进入早期临床研究或临床前研究。但是他们的具体行动方式仍然晦涩难懂。BBM的结构特征与这些抑制剂的特征不同，因为它显示出高的刚度和平面度，从而使BBM和STAT3的结合构象更加独特。因此，本研究进行分子对接和MD模拟，以探索BBM和STAT3之间的潜在相互作用模式和关键结合位点。分子对接和模拟分析表明，BBM主要取决于与STAT3Ser-636附近的几个亲水残基的极性相互作用。为了克服BBM的低水溶性，这是BBM研究的重要课题之一，通过改变其结构来改善其成药性非常重要。根据我们的分子模拟结果，在BBM的羟基中引入一些亲水性官能团可以有效提高其溶解度，并提供更有效的抑制活性。另外，以脂质体或纳米颗粒形式的BBM的制备也可以增加BBM的生物利用度和肿瘤靶向性。
　　 综上所述，本研究表明，BBM可以增强Gefi对Panc-1和Miapaca-2细胞的抑制增殖，抑制细胞周期和促进细胞凋亡的作用。关于潜在的机制，这项研究的结果表明，BBM直接与STAT3结合，并有助于Gefi减少PC细胞中的STAT3信号。最后，BBM/STAT3复合物的分子对接和分子模拟显示，这两个分子之间的稳定结合取决于亲水性相互作用。