随着发病率和死亡率逐年增加，癌症已成为世界范围内的主要公共卫生问题。作为在中国常见的恶性消化道肿瘤之一，胰腺癌的发病率已经迅速在最近几年有所增加，这是癌症相关死亡的十大原因中的一个。PC的死亡率位居全球前四；这就是被称为“癌症之王”的原因。而且，PC患者的早期诊断率不高，大多数被诊断为晚期，预后很差。因此，早期诊断对于PC患者至关重要。当前的研究发现，遗传和表观遗传调控在PC的发病机制中起着重要作用，例如KRAS基因的激活和突变。删除肿瘤抑制基因p16，TP53，SMAD4/DPC4和BPCA2;以及microRNA的失控。但尽管碳水化合物抗原19-9被认为是检测PC的黄金标准，但目前尚无诊断PC的特异性标志物。增加的CA199被欧洲肿瘤标记物小组和美国国家临床生物化学研究院用于诊断PC，在非肿瘤患者中，CA199的水平也升高和阻塞性黄疸。因此，除了CA199以外，还需要新的生物标志物用于PC的早期诊断，靶向治疗和预后。
　　 锌指蛋白在的TFIIIA发现爪蟾卵母细胞中的早期1983年，它广泛分布于真核生物和功能，以调节基因表达，细胞分化，和胚胎发育。MYC相关的锌指蛋白在人的心脏，肺，脑，肝脏，骨骼肌，前列腺和胰腺中表达。以往的研究表明，MAZ蛋白不仅转录激活一些基因，如c-myc基因，VEGF，拉斯基因家族和PDPN，一些基因的同时也终止转录，如eNOS的Sp4和p53。日前，MAZ的异常表达在oblastoma，脂肪肉瘤，乳腺癌和前列腺癌中发现，和它被发现是密切相关的这些肿瘤的发展。然而，尚未报道MAZ表达和临床病理特征和PC患者预后的关系。本研究通过免疫组织化学和蛋白质印迹研究MAZ在成对的PC和邻近非肿瘤组织中的表达及其临床意义，并通过RNA干扰探索MAZ在PC细胞中的生物学功能。最后，发现MAZ在PC组织中过度表达，这与PC患者的预后相关。另外，发现MAZ可促进PC细胞的增殖，侵袭和迁移能力。这项研究表明，MAZ是PC发病机制中的致癌基因。
　　 从2015年至2016年间，从桂林医科大学附属医院接受手术的PC患者中收集八份新鲜的PC组织和成对的相邻非肿瘤组织进行Westernblot分析。另外，还从该科收集用于免疫组化分析的另外57例PC组织和41对成对的相邻非肿瘤组织进行了IHC分析。从临床和病理学方法诊断出的PC患者中收集PC组织，并且PC组织与相邻的非肿瘤组织之间的距离大于2cm。所有这些PC患者均接受手术治疗而未进行放疗或化学治疗，并且所有患者的完整临床数据均可用。所有样本均根据患者或其家属的协议以及书面知情同意书获得，并得到桂林医科大学附属医院伦理委员会的批准。
　　 首先将石蜡包埋的组织在60°C下加热1小时，然后使用二甲苯进行脱蜡。在一系列梯度乙醇中水合后，将这些组织置于EDTA缓冲液中进行高压加热修复，然后在3％过氧化氢溶液中浸泡15分钟以去除内源性过氧化物酶。然后在室温下用马血清封闭30分钟后，将样品与一抗MAZ在37°C孵育1小时。然后，添加第二种抗体，并在37°C下孵育30分钟。然后，将组织用DAB处理3-5分钟，直到在显微镜下观察到合适的颜色为止。最后，将它们用苏木精复染，用自来水冲洗，脱水，使其透明，随机选择五个字段对IHC结果进行评分。使用显微镜以高倍计分。计数染色阳性的细胞百分比和染色强度以进行评估。1）染色强度得分：无色为0分，浅黄色为1分，黄棕色为2分，棕色为3分。2）阳性细胞百分比评分：阴性为0分，小于10％为1分，11％–50％为2分，51％–75％为3分，大于75％为4分。最终分数是上述两个分数的乘积。得分>6定义为高表达，≤6定义为低表达。
　　 人胰腺细胞系HPDE6C7和其他胰腺癌细胞系购自ATCC细胞库。在含有10％胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中培养HPDE6C7和PANC-1细胞。在含有10％FBS的RoswellParkMemorialInstitute-1640培养基中培养ASPC-1和BXPC-3细胞，而在含有10％FBS的Iscove'sModifiedDulbecco's培养基中培养CFPAC-1细胞。将所有细胞在37℃与5％CO2孵育。Genechem构建了四个靶向MAZ和阴性对照shGFP的shRNA。这些shRNA被转移到胰腺癌细胞系中，并通过WB验证它们的敲低效应。最后，选择shMAZ-1＃和shMAZ-2＃进行后续实验。用含有1％PMSF的RIPA缓冲液裂解细胞或组织样品，然后通过BCA测定蛋白质的浓度。每孔上样20微克蛋白质以进行SDS-PAGE。电泳后，将蛋白质转移到PVDF膜上，并在用5％无脂牛奶封闭后于4°C过夜涂以特异性一抗包被。然后，将膜用TBST缓冲液洗涤，并与二抗在室温下孵育1小时。最后，通过化学发光使条带可视化。
　　 使用CCK8试剂盒根据制造商的方案在细胞接种后6小时，12小时，24小时，48小时和72小时评估细胞增殖。细胞以8,000个细胞/孔的密度在96孔板中一式三份生长。在设定时间加入CCK-8试剂，并在37℃下孵育1小时。然后，将这些细胞用于在酶标仪上检测450nm处的光密度值。细胞在6孔板中一式三份以500个细胞/孔的密度生长。培养2周后，将细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤两次。然后，将细胞用4％多聚甲醛固定15分钟，并用结晶紫染色2小时。最后，将它们用去离子水洗涤三遍，然后拍照。在显微镜下计数细胞集落。根据供应商的说明书，使用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒确定细胞凋亡。每个细胞系至少测试三次，并通过流式细胞仪定量确定凋亡细胞。
　　 使用涂有Matrigel的BDTranswell腔室检测细胞侵袭，并使用不带Matrigel涂层的BDTranswell腔室检测细胞迁移。腔室孔为8um。将该室置于具有无血清培养基的24孔板中，并孵育1小时以使其活化。然后，将100uL无血清培养基中的2×104个细胞添加到上腔室中，并将含10％FBS的600uL培养基添加到下腔室中。温育24小时后，将细胞用4％多聚甲醛固定并用1％结晶紫染色。基质胶和剩余的细胞被擦去。用PBS洗涤后，照相细胞并在显微镜下计数。使用SPSS19.0分析所有结果。使用分析临床病理参数和MAZ表达之间的相关性χ2测试。生存概率通过Kaplan–Meier方法估算，各组之间的生存曲线比较采用对数秩检验。所有测试的统计显着性水平均设置为P<0.05。
　　 为了评估MAZ和PC之间的关系，首先通过WB在八对配对的新鲜PC和相邻的非肿瘤组织中检测MAZ蛋白的表达。在8个PC组织中的7个中发现MAZ蛋白的表达增加，表明MAZ在PC组织中过表达。然后，进行IHC分析以确定MAZ在另外57个PC组织中的表达。MAZ在细胞质和细胞核中均表达，但主要位于细胞质中。与邻近的非肿瘤组织相比，PC组织中的MAZ明显更高，这与WB结果一致。为了确定MAZ对PC的预后价值，收集了57例PC患者的临床病理特征，以分析MAZ表达与PC之间的相关性。根据IHC的MAZ染色评分，将患者分为两组。与比较后χ2检验，有高MAZ表达组和年龄的低MAZ表达组，肿瘤大小，肿瘤数，和CA199水平，而MAZ表达与没有显著关系其他特征，例如性别，吸烟，饮酒，肿瘤分级和转移。还通过Kaplan–Meier方法分析了MAZ表达与PC患者预后之间的相关性。有41例高表达MAZ的PC患者和16例低表达MAZ的PC患者。与低MAZ表达组相比，高MAZ表达组的术后生存时间显着减少。这些结果表明，过度表达的MAZ与PC患者的预后不良有关，表明MAZ可能在PC发病机理中起作用。
　　 为了探索MAZ在PC发病机理中的作用，关注托姆刀的胰腺癌治疗网通过WB检测MAZ蛋白在四种胰腺癌细胞系ASPC-1，CFPAC-1，PANC-1和BXPC-3中的表达。与正常胰腺细胞系HPDE6C7相比，MAZ在这四个PC细胞系中，特别是在PANC-1细胞中具有更高的表达。因此，选择PANC-1细胞用于随后的实验。同时，购买了四个shMAZ来敲低MAZ表达和一个阴性对照shGFP。将这些shRNA转移到PANC-1细胞后，与shGFP相比，四种shMAZ对MAZ表达具有显着的抑制作用。由于shMAZ-1＃和shMAZ-2＃都击倒MAZ表达的70％以上，因此选择它们来构建MAZ击倒细胞系探索MAZ在PC发病机理中的作用。
　　 为了评估MAZ敲低对细胞增殖的影响，在构建的PANC-1-shMAZ细胞中进行CCK-8和集落形成分析。与PANC-1-shGFP细胞相比，PANC-1-shMAZ-1＃和PANC-1-shMAZ-2＃细胞中的MAZ表达分别降低70％和80％。此外，PANC-1-shMAZ-1＃和PANC-1-shMAZ-2＃细胞的增殖均显着降低。根据该结果，PANC-1-shMAZ细胞的集落数也小于PANC-1-shGFP细胞的集落数。此外，PANC-1-shMAZ细胞的凋亡要大于PANC-1-shGFP细胞的凋亡。结果表明MAZ可以促进PC细胞的增殖并抑制其凋亡。由于MAZ表达与PC患者的预后相关，关注托姆刀的胰腺癌治疗网试图找出MAZ是否影响PC细胞的转移。通过Transwell测定法检测PANC-1细胞的侵袭和迁移能力。MAZ的PANC-1细胞的下调与对照PANC-1-的shGFP细胞。该结果表明MAZ也对PC细胞的侵袭和迁移有影响，这可能导致PC患者的预后不良。为了进一步阐明MAZ在PC细胞增殖中的作用，检测PC-和研究过MAZ的相邻非肿瘤组织中Ki-67的表达。Ki-67的在PC和相邻的非肿瘤组织中表达。但是，PC组织中Ki-67的表达明显高于相邻的非肿瘤组织。此外，发现Ki-67的表达与肿瘤直径有关。Ki-67在肿瘤直径大于5cm的PC组织中的表达明显高于在肿瘤直径小于5cm的PC组织中的表达。由于MAZ和Ki-67都在PC组织中过表达，因此关注托姆刀的胰腺癌治疗网进行相关分析。在PC组织中MAZ和Ki-67的表达水平之间存在正相关，表明MAZ通过促进PC细胞增殖而参与PC的发病。
　　 PC是导致最高死亡率的一种恶性实体瘤，并且是世界上严重的健康问题。由于隐匿性发作，大多数PC患者被诊断为晚期，因此只有约10％–20％的PC患者有资格接受根治性手术。PC患者的平均存活时间仅约6个月。肿瘤发生是一个多步骤过程，其中涉及多个基因，例如癌基因的异常激活和肿瘤抑制基因的失活，从而导致一系列下游信号传导级联的改变。锌指蛋白与许多基因的表达调控，细胞分化和肿瘤发生有关。如锌指蛋白的成员，MAZ不仅对引起氧气不足或血液肿瘤屏障，结肠炎的调节中起重要作用，而且在调节c-myc基因，VEGF，p53基因，的Ras，和小窝结构蛋白小窝蛋白-1。以前的研究表明，MAZ在胶质母细胞瘤，乳腺癌，前列腺癌，肉瘤和过表达，这表明患者预后不良。但尚未报道MAZ与PC之间的关系，并且还不清楚MAZ在PC中扮演的角色。
　　 关注托姆刀的胰腺癌治疗网的研究首次显示PC组织中MAZ的高表达。此外MAZ的高表达与PC患者的年龄，肿瘤直径，肿瘤数目和血清CA199水平相关。此外，生存分析表明，高表达MAZ的PC患者比低表达MAZ的PC患者的预后差，这与先前的报告一致，后者表明乳腺癌中MAZ上调会影响乳腺癌患者的预后。发现MAZ在前列腺癌细胞中被上调并且对雄激素受体的转录进行正向调节。当MAZ沉默时，前列腺癌细胞的细胞增殖以及侵袭和迁移的能力降低。MAZ还可以通过人胶质母细胞瘤中VEGF的转录调控来促进肿瘤血管生成。此外，据报道MAZ通过直接调节RET信号传导途径中的效应物GNDF与SPN1协同作用来调节脂肪肉瘤细胞的增殖和凋亡。这些研究表明，MAZ在肿瘤细胞的增殖，侵袭和迁移中起作用。关注托姆刀的胰腺癌治疗网的研究还通过敲低PANC-1细胞中的MAZ证实MAZ的这些功能，这表明MAZ在PC的发病机理中起着致癌作用。MAZ与细胞增殖标志物Ki-67之间的相关性进一步支持这一结论。然而，MAZ和Ki-67之间的具体调控机制有待进一步探索。尽管发现MAZ促进PC细胞的体外侵袭和迁移，但MAZ与PC患者的转移之间没有显着相关性。
　　 这可能是由于关注托姆刀的胰腺癌治疗网的研究样本量较小，并且将来关注托姆刀的胰腺癌治疗网将增加PC组织的数量来进行研究。总之，关注托姆刀的胰腺癌治疗网发现MAZ在PC组织中过度表达，并且与PC患者的预后不良有关。此外，MAZ促进人类PC细胞的增殖，侵袭和迁移，表明MAZ在PC的发病机理中具有致癌作用。这些结果证明MAZ可用作PC的治疗和预后的生物标志物。