胰腺导管腺癌是癌症相关死亡的第三大原因，其五年生存率接近9％。到2030年，PDAC有望成为导致癌症死亡的第二大原因。化疗，放疗和手术是PDAC的治疗策略。然而，超过80％的患者错过手术切除的机会。早期检测PDAC可以提高生存率。CA19-9已用作PDAC检测的生物标记。但由于血清CA19–9的阳性预测价值较低，因此不能用作筛选标记。迫切需要寻找可以检测早期PDAC并预测临床结果的新型诊断生物标志物。先前的研究已经报道循环蛋白，代谢产物和miRNA。越来越多的研究表明，外来体是PDAC一个潜在的诊断标志物。外来体即从各种体液，衍生50-150纳米小膜囊泡中含有大量的含有信息的因素，包括的mRNA，miRNA的，脂类和蛋白质。循环胰腺癌外泌体RNA是早期检测PDAC的有用工具。外泌体Glypican-1可能是检测胰腺癌早期阶段的一种非侵入性诊断和筛选工具。肿瘤相关的miRNA退出并在生物过程中发挥关键作用。由于外泌体囊泡的保护作用，泌体miRNA在体液中相对稳定，尤其是在血液中。
　　 稳定性的这一特征表明，外泌体miRNA可能是良好的潜在生物标志物。一些研究表明，血液中miRNA的表达与PDAC的预后相关，这表明miRNA可能是潜在的诊断生物标志物或预测肿瘤的侵袭。然而，很少有研究显示外泌体miRNA在检测胰腺癌早期阶段中的作用。在这项研究中，从血清中分离出外泌体miRNA，并评估了健康人，PDAC患者和胰腺良性病变患者外泌体miRNA的表达水平。这项研究的目的是探索早期检测PDAC的外泌体miRNA的潜在生物标记。此外，还研究候选外泌体miRNA与PDAC患者和胰腺细胞系中肿瘤浸润或转移之间的关系。
　　 在2017年4月至2019年4月期间，从3名健康个体，PDAC患者，胰腺良性病变患者采集血液样本。将外周血样本以5000rmp的速度离心在4°C下放置10分钟。将血清分离到EP管中，并保存在-80℃下直至进一步使用。血清样本分为三组：5个PDAC对3个HI，5个PDAC对5个BP和17个PDAC对12PB。前两组用于下一代测序分析。二十九个样本用于验证所选的潜在生物标记。从每个受试者获得书面知情同意书，并且研究的所有方面均得到南京中医药大学伦理委员会的批准。该研究是根据相关准则进行的，使用exoEasyMaxiKit根据制造商的说明分离血清外泌体。研究了外泌体来源的分化CD63簇的表达，以通过蛋白质印迹分析鉴定外泌体。从血清中分离出的外泌体沉淀用RIPA裂解缓冲液处理。透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析也用于鉴定外泌体。
　　 使用miRNeasy血清/血浆试剂盒从血清外来体中提取总RNA。按照制造商的说明进行RNA提取，并使用NanoDropND-1000分光光度计对RNA浓度进行定量。所有RNA样品的OD260/280nm比率均≥1.8。使用用于Illumina测序仪的NewEnglandBiolabsNEBNext多重小RNA文库制备试剂盒构建小RNA文库，并且先前已经报道了NEB标准方案。在IlluminaHiseqX平台上对合格的文库制备物进行测序。使用Flow，v3.0，Bowtie和miRbasev20进行衔接子修饰和序列分析，以进行比对和注释。通过定量实时聚合酶链反应进一步确认了候选miRNA。定量RT-PCR使用QuantiFast执行SYBR绿色PCR主混合物在ABI9700的qPCR系统。将目标miRNA的相对基因表达值标准化为RNU6B，并使用Ct方法计算差异。GAPDH被选为内部参考。设计发夹结构引物，以使用pCD316-ZsGreen-siRNA构建miRNA-1226过表达质粒。
　　 CCK8用于评估miRNA-1226过表达对细胞增殖的影响。简而言之，将PANC-1和BXP-3细胞接种到6孔板中。当细胞汇合达到80％时，用对照质粒和miRNA-1226-3p过表达质粒转染两个细胞。24小时后，收获细胞并在96孔板中培养24小时。然后，向每个孔中加入10uLCCK8溶液，并将板在培养箱中孵育1-4小时。然后，使用酶标仪在450nm处测量孔。进行流式细胞仪分析，以分析miRNA-1226过表达对细胞凋亡或坏死和增殖的影响。用对照质粒和miRNA-1226-3p过表达质粒转染PANC-1和BXP-3细胞48小时。然后，在每个孔中加入500uL不含EDTA的胰蛋白酶以消化细胞2分钟，并在4°C下以1500rpm离心5分钟以收获细胞。然后，将其用冷磷酸盐缓冲盐水洗涤3次，并用AnnexinV-FITC/PI染色。随后，将400uL结合缓冲液添加到每个细胞中，然后使用300目尼龙网过滤。然后通过流式细胞仪检测FL1和FL3两通道波长的细胞。通过伤口愈合测定法和transwell室法测量迁移率。使用移液管尖端进行伤口处理，并在受伤后24小时立即拍摄照片。测量在该时间段内细胞迁移的距离或细胞迁移的数量。
　　 CT图像是使用64通道多探测器CT扫描仪获得的。成像参数已在以前报道过。两名腹部放射科医生对CT图像进行了独立检查。如果不一致，则由具有20年以上腹部放射学经验的第三位放射线医师决定达成共识。变量包括：大小，肿瘤边缘，形状，成分，肿瘤衰减，胰腺或胆管扩张，转移或浸润。变量的定义和分类已在之前进行了报道。所有统计分析均使用市售软件进行。定量数据表示为平均值±SD。使用Bonferroni校正或独立样本T检验进行单向方差分析，以进行统计分析。接收器工作特征曲线用于评估候选外泌体miRNA的诊断性能。P值<0.05被认为具有统计学意义。
　　 TEM和NTA分析的结果表明，外泌体是具有双脂质层的杯状囊泡，回收的颗粒中>90％的颗粒直径小于200nm。WB显示外泌体CD63阳性。WB显示小型RNA文库符合测序要求。九十个外泌体miRNA显示PDAC与3His之间的表达改变。上调29个miRNA，下调了61个。总共59个外泌体miRNA显示PDAC和BP之间的表达改变，包括28个上调的miRNA和31个下调的miRNA。随后，那些miRNA在PDAC和HIS之间以及在PDAC和BP之间显示出相同的变化模式。胰腺癌治疗网发现6个miRNA上调和五个下调。选择表达差异最大的四个miRNA作为PDACs生物标志物进行miRNA验证。在PDAC和BP之间，在miR-203a-3p，miR-149-5p和miR-624-5p中未观察到显着差异。与PDAC相比，BP患者的血清外泌体miRNA-1226-3p表达显着更高。构建ROC曲线分析以评估miRNA-1226-3p对PDAC的诊断价值，曲线下面积为0.74。
　　 评估外泌体miRNA-1226-3p与肿瘤成分，胰腺或胆管扩张，浸润或转移之间的关联。miRNA-1226-3p的表达与PDAC的侵袭或转移之间存在显着的负相关性。在miRNA-1226-3p与肿瘤成分，肿瘤增强，胰腺或胆管扩张之间未发现显着相关性。随后，胰腺癌治疗网观察了miRNA-1226对PDAC体外生物学行为的影响。用miRNA-1226转染的PANC-1和BXP-3中miRNA-1226的水平显着高于对照。转染miRNA-1226-3p的PANC-1和BXP-3细胞的增殖低于转染对照miRNA的PANC-1和BXP-3细胞。还观察到细胞凋亡和迁移。转染miRNA-1226的PDACs细胞的凋亡远低于对照组,而且迁移能力低于对照组。
　　 在临床实践中，早期检测PDAC仍然是一个挑战。诊断时超过80％的患者是局部晚期或转移性疾病，并且错过手术切除的机会。找到更敏感的诊断生物标志物，以早期检测PDAC并预测侵袭或转移，将是有价值的。通过使用循环蛋白，代谢产物和miRNA做出了许多努力。但很少有研究表明外泌体miRNA在PDAC检测中的作用。数据表明，外泌体miRNA-1226在PDAC检测中可能具有潜力。此外数据显示miRNA-1226与PDAC的生物学行为有关。miRNA-1226低表达与较差的生物学行为有关。最近，许多研究表明，miRNA可以调节肿瘤的侵袭和迁移，也可以用作肿瘤诊断的生物标志物。循环miRNA与PDAC的发展和预后有关。30种miRNA在PDAC被上调。miRNA-203是PDAC中的一种新的预后生物标志物，与慢性胰腺炎和正常胰腺样本相比，它在PDAC中也过表达。先前的报告显示，miRNA-203在panc-1细胞及其外泌体中表达。然而，尚不清楚外泌体miRNA是否可用于检测PDAC。
　　 外泌体被认为是一种非侵入性生物标记物的新型来源，因为外泌体含有肿瘤特异性分子。许多研究已经证明，外来体可以用作用于诊断PDAC生物标志物。此外，一些研究已经报道了外来体的miRNA可以提高癌症检测的精度。血浆外来体的miR-196A和miR-1246是局部胰腺癌的两个潜在指标。最近的一项研究表明，胰腺囊肿汁中的外泌体miRNA可能是检测PDAC的生物标记。在这项研究中，胰腺癌治疗网鉴定11个在PDAC和HIs或BPs之间表达改变的miRNA。通过RT-PCR验证了四个miRNA，发现miRNA-1226是PDAC和BP区分的生物标志物。数据还表明，外泌体miRNA-1226-3P表达水平低与PDAC的肿瘤浸润或转移有关。miRNA-1226通过抑制MUC1癌蛋白的表达来促进细胞死亡的诱导。数据与本报告一致。MUC1是PDAC的组织学生物标志物。最近的一项研究表明，特异性抗MUC1抗体可以在小鼠模型中抑制胰腺癌的进展。推测miRNA-1226-3P也可能通过下调MUC1来抑制PDAC。
　　 据胰腺癌治疗网所知，这是第一项检查血清外泌体miRNA表达与CT影像学发现之间相关性的研究。但在miRNA-1226-3p与大小，肿瘤成分，肿瘤增强，胰腺或胆管扩张之间未发现显着相关性。将来需要进一步的研究。来自胰腺癌细胞的外泌体miRNA可能会促进侵袭和转移或化学耐药性，例如miRNA-222和miRNA-155。在本研究中还进行体外研究，以测试miRNA-1226-3p在PDAC生物学行为中的作用。有趣的是发现高水平的miRNA-1226-3p表达可以抑制PANC-1和BXP-3细胞的活力，促进细胞凋亡并抑制细胞迁移。这些作用可能与miRNA-1226-3P对MUC1的抑制有关。数据表明，miRNA-1226-3p可能是PDAC治疗的潜在药物。
　　 本研究存在一些局限性。首先，测序分析和验证队列中的样本数量很少。此外，验证队列中没有健康的个体。未来需要大量验证队列的研究来评估外泌体miRNA-1226的诊断和预测价值。其次仅验证了4种外泌体miRNA。需要进一步的研究来证明其他miRNA表达改变的价值。第三，研究没有分析miRNA-1226与TNM分期，PDAC分化或PDAC预后之间的关系。最后没有进行体内研究来评估miRNA-1226在肿瘤生长中的作用。总而言之，这项研究表明，与健康个体和BP相比，PDAC中的血清外泌体miRNA-1226-3p被下调。外泌体miRNA-1226可能是PDAC检测的潜在生物标志物。此外还表明，miRNA-1226-3p的表达与PDAC的侵袭或转移呈负相关。miRNA-1226-3p的过表达可抑制PDAC细胞增殖，细胞迁移并促进细胞凋亡。