胰腺癌
 
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胰腺导管腺癌的潜在生物标志物

  胰腺导管腺癌是癌症相关死亡的第三大原因,其五年生存率接近9%。到2030年,PDAC有望成为导致癌症死亡的第二大原因。化疗,放疗和手术是PDAC的治疗策略。然而,超过80%的患者错过手术切除的机会。早期检测PDAC可以提高生存率。CA19-9已用作PDAC检测的生物标记。但由于血清CA19–9的阳性预测价值较低,因此不能用作筛选标记。迫切需要寻找可以检测早期PDAC并预测临床结果的新型诊断生物标志物。先前的研究已经报道循环蛋白,代谢产物和miRNA。越来越多的研究表明,外来体是PDAC一个潜在的诊断标志物。外来体即从各种体液,衍生50-150纳米小膜囊泡中含有大量的含有信息的因素,包括的mRNA,miRNA的,脂类和蛋白质。循环胰腺癌外泌体RNA是早期检测PDAC的有用工具。外泌体Glypican-1可能是检测胰腺癌早期阶段的一种非侵入性诊断和筛选工具。肿瘤相关的miRNA退出并在生物过程中发挥关键作用。由于外泌体囊泡的保护作用,泌体miRNA在体液中相对稳定,尤其是在血液中。
   稳定性的这一特征表明,外泌体miRNA可能是良好的潜在生物标志物。一些研究表明,血液中miRNA的表达与PDAC的预后相关,这表明miRNA可能是潜在的诊断生物标志物或预测肿瘤的侵袭。然而,很少有研究显示外泌体miRNA在检测胰腺癌早期阶段中的作用。在这项研究中,从血清中分离出外泌体miRNA,并评估了健康人,PDAC患者和胰腺良性病变患者外泌体miRNA的表达水平。这项研究的目的是探索早期检测PDAC的外泌体miRNA的潜在生物标记。此外,还研究候选外泌体miRNA与PDAC患者和胰腺细胞系中肿瘤浸润或转移之间的关系。
   在2017年4月至2019年4月期间,从3名健康个体,PDAC患者,胰腺良性病变患者采集血液样本。将外周血样本以5000rmp的速度离心在4°C下放置10分钟。将血清分离到EP管中,并保存在-80℃下直至进一步使用。血清样本分为三组:5个PDAC对3个HI,5个PDAC对5个BP和17个PDAC对12PB。前两组用于下一代测序分析。二十九个样本用于验证所选的潜在生物标记。从每个受试者获得书面知情同意书,并且研究的所有方面均得到南京中医药大学伦理委员会的批准。该研究是根据相关准则进行的,使用exoEasyMaxiKit根据制造商的说明分离血清外泌体。研究了外泌体来源的分化CD63簇的表达,以通过蛋白质印迹分析鉴定外泌体。从血清中分离出的外泌体沉淀用RIPA裂解缓冲液处理。透射电子显微镜和纳米颗粒跟踪分析也用于鉴定外泌体。
   使用miRNeasy血清/血浆试剂盒从血清外来体中提取总RNA。按照制造商的说明进行RNA提取,并使用NanoDropND-1000分光光度计对RNA浓度进行定量。所有RNA样品的OD260/280nm比率均≥1.8。使用用于Illumina测序仪的NewEnglandBiolabsNEBNext多重小RNA文库制备试剂盒构建小RNA文库,并且先前已经报道了NEB标准方案。在IlluminaHiseqX平台上对合格的文库制备物进行测序。使用Flow,v3.0,Bowtie和miRbasev20进行衔接子修饰和序列分析,以进行比对和注释。通过定量实时聚合酶链反应进一步确认了候选miRNA。定量RT-PCR使用QuantiFast执行SYBR绿色PCR主混合物在ABI9700的qPCR系统。将目标miRNA的相对基因表达值标准化为RNU6B,并使用Ct方法计算差异。GAPDH被选为内部参考。设计发夹结构引物,以使用pCD316-ZsGreen-siRNA构建miRNA-1226过表达质粒。
   CCK8用于评估miRNA-1226过表达对细胞增殖的影响。简而言之,将PANC-1和BXP-3细胞接种到6孔板中。当细胞汇合达到80%时,用对照质粒和miRNA-1226-3p过表达质粒转染两个细胞。24小时后,收获细胞并在96孔板中培养24小时。然后,向每个孔中加入10uLCCK8溶液,并将板在培养箱中孵育1-4小时。然后,使用酶标仪在450nm处测量孔。进行流式细胞仪分析,以分析miRNA-1226过表达对细胞凋亡或坏死和增殖的影响。用对照质粒和miRNA-1226-3p过表达质粒转染PANC-1和BXP-3细胞48小时。然后,在每个孔中加入500uL不含EDTA的胰蛋白酶以消化细胞2分钟,并在4°C下以1500rpm离心5分钟以收获细胞。然后,将其用冷磷酸盐缓冲盐水洗涤3次,并用AnnexinV-FITC/PI染色。随后,将400uL结合缓冲液添加到每个细胞中,然后使用300目尼龙网过滤。然后通过流式细胞仪检测FL1和FL3两通道波长的细胞。通过伤口愈合测定法和transwell室法测量迁移率。使用移液管尖端进行伤口处理,并在受伤后24小时立即拍摄照片。测量在该时间段内细胞迁移的距离或细胞迁移的数量。
   CT图像是使用64通道多探测器CT扫描仪获得的。成像参数已在以前报道过。两名腹部放射科医生对CT图像进行了独立检查。如果不一致,则由具有20年以上腹部放射学经验的第三位放射线医师决定达成共识。变量包括:大小,肿瘤边缘,形状,成分,肿瘤衰减,胰腺或胆管扩张,转移或浸润。变量的定义和分类已在之前进行了报道。所有统计分析均使用市售软件进行。定量数据表示为平均值±SD。使用Bonferroni校正或独立样本T检验进行单向方差分析,以进行统计分析。接收器工作特征曲线用于评估候选外泌体miRNA的诊断性能。P值<0.05被认为具有统计学意义。
   TEM和NTA分析的结果表明,外泌体是具有双脂质层的杯状囊泡,回收的颗粒中>90%的颗粒直径小于200nm。WB显示外泌体CD63阳性。WB显示小型RNA文库符合测序要求。九十个外泌体miRNA显示PDAC与3His之间的表达改变。上调29个miRNA,下调了61个。总共59个外泌体miRNA显示PDAC和BP之间的表达改变,包括28个上调的miRNA和31个下调的miRNA。随后,那些miRNA在PDAC和HIS之间以及在PDAC和BP之间显示出相同的变化模式。胰腺癌治疗网发现6个miRNA上调和五个下调。选择表达差异最大的四个miRNA作为PDACs生物标志物进行miRNA验证。在PDAC和BP之间,在miR-203a-3p,miR-149-5p和miR-624-5p中未观察到显着差异。与PDAC相比,BP患者的血清外泌体miRNA-1226-3p表达显着更高。构建ROC曲线分析以评估miRNA-1226-3p对PDAC的诊断价值,曲线下面积为0.74。
   评估外泌体miRNA-1226-3p与肿瘤成分,胰腺或胆管扩张,浸润或转移之间的关联。miRNA-1226-3p的表达与PDAC的侵袭或转移之间存在显着的负相关性。在miRNA-1226-3p与肿瘤成分,肿瘤增强,胰腺或胆管扩张之间未发现显着相关性。随后,胰腺癌治疗网观察了miRNA-1226对PDAC体外生物学行为的影响。用miRNA-1226转染的PANC-1和BXP-3中miRNA-1226的水平显着高于对照。转染miRNA-1226-3p的PANC-1和BXP-3细胞的增殖低于转染对照miRNA的PANC-1和BXP-3细胞。还观察到细胞凋亡和迁移。转染miRNA-1226的PDACs细胞的凋亡远低于对照组,而且迁移能力低于对照组。
   在临床实践中,早期检测PDAC仍然是一个挑战。诊断时超过80%的患者是局部晚期或转移性疾病,并且错过手术切除的机会。找到更敏感的诊断生物标志物,以早期检测PDAC并预测侵袭或转移,将是有价值的。通过使用循环蛋白,代谢产物和miRNA做出了许多努力。但很少有研究表明外泌体miRNA在PDAC检测中的作用。数据表明,外泌体miRNA-1226在PDAC检测中可能具有潜力。此外数据显示miRNA-1226与PDAC的生物学行为有关。miRNA-1226低表达与较差的生物学行为有关。最近,许多研究表明,miRNA可以调节肿瘤的侵袭和迁移,也可以用作肿瘤诊断的生物标志物。循环miRNA与PDAC的发展和预后有关。30种miRNA在PDAC被上调。miRNA-203是PDAC中的一种新的预后生物标志物,与慢性胰腺炎和正常胰腺样本相比,它在PDAC中也过表达。先前的报告显示,miRNA-203在panc-1细胞及其外泌体中表达。然而,尚不清楚外泌体miRNA是否可用于检测PDAC。
   外泌体被认为是一种非侵入性生物标记物的新型来源,因为外泌体含有肿瘤特异性分子。许多研究已经证明,外来体可以用作用于诊断PDAC生物标志物。此外,一些研究已经报道了外来体的miRNA可以提高癌症检测的精度。血浆外来体的miR-196A和miR-1246是局部胰腺癌的两个潜在指标。最近的一项研究表明,胰腺囊肿汁中的外泌体miRNA可能是检测PDAC的生物标记。在这项研究中,胰腺癌治疗网鉴定11个在PDAC和HIs或BPs之间表达改变的miRNA。通过RT-PCR验证了四个miRNA,发现miRNA-1226是PDAC和BP区分的生物标志物。数据还表明,外泌体miRNA-1226-3P表达水平低与PDAC的肿瘤浸润或转移有关。miRNA-1226通过抑制MUC1癌蛋白的表达来促进细胞死亡的诱导。数据与本报告一致。MUC1是PDAC的组织学生物标志物。最近的一项研究表明,特异性抗MUC1抗体可以在小鼠模型中抑制胰腺癌的进展。推测miRNA-1226-3P也可能通过下调MUC1来抑制PDAC。
   据胰腺癌治疗网所知,这是第一项检查血清外泌体miRNA表达与CT影像学发现之间相关性的研究。但在miRNA-1226-3p与大小,肿瘤成分,肿瘤增强,胰腺或胆管扩张之间未发现显着相关性。将来需要进一步的研究。来自胰腺癌细胞的外泌体miRNA可能会促进侵袭和转移或化学耐药性,例如miRNA-222和miRNA-155。在本研究中还进行体外研究,以测试miRNA-1226-3p在PDAC生物学行为中的作用。有趣的是发现高水平的miRNA-1226-3p表达可以抑制PANC-1和BXP-3细胞的活力,促进细胞凋亡并抑制细胞迁移。这些作用可能与miRNA-1226-3P对MUC1的抑制有关。数据表明,miRNA-1226-3p可能是PDAC治疗的潜在药物。
   本研究存在一些局限性。首先,测序分析和验证队列中的样本数量很少。此外,验证队列中没有健康的个体。未来需要大量验证队列的研究来评估外泌体miRNA-1226的诊断和预测价值。其次仅验证了4种外泌体miRNA。需要进一步的研究来证明其他miRNA表达改变的价值。第三,研究没有分析miRNA-1226与TNM分期,PDAC分化或PDAC预后之间的关系。最后没有进行体内研究来评估miRNA-1226在肿瘤生长中的作用。总而言之,这项研究表明,与健康个体和BP相比,PDAC中的血清外泌体miRNA-1226-3p被下调。外泌体miRNA-1226可能是PDAC检测的潜在生物标志物。此外还表明,miRNA-1226-3p的表达与PDAC的侵袭或转移呈负相关。miRNA-1226-3p的过表达可抑制PDAC细胞增殖,细胞迁移并促进细胞凋亡。

 
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  由著名肿瘤医学家、首届“国之名医—卓越建树奖”获得者夏廷毅教授担任医学总顾问;著名放射肿瘤物理学家、中国肿瘤放疗事业特殊贡献奖获得者张红志教授担任物理技术总顾问,领率国家一大批肿瘤放疗专家和物理师组建专业团队,聚焦精准放疗,整合多学科资源,通过专家下沉基层开展医疗技术服务,助推肿瘤精准放射医学产、学、研、用全链条一体化发展,全面提高全国各地肿瘤病人精准放疗可及性和综合治疗水平,最大限度满足肿瘤患者就地就近享受高水准、高质量人性化诊疗服务。
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