胰腺癌
 
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抑制胰腺癌细胞的增殖,迁移和侵袭

  胰腺癌是消化系统常见的恶性肿瘤,特征是起病隐匿,恶性程度高,发展迅速,预后差五年生存率不足6%。在西方国家中,胰腺癌已是恶性肿瘤相关死亡的第四大原因,到2030年胰腺癌预计将在美国癌症相关死亡的第二大原因。手术切除联合化疗仍然是主要的临床治疗胰腺癌。然而,多种并发症和对化疗药物不敏感已成为复发和转移的主要原因。因此,迫切需要深入了解胰腺癌发生和发展的分子机制,以找到治疗胰腺癌的有效策略。TMEFF2是EGF样蛋白家族的一个新成员,近年来发现它具有抑癌特性,因为它可以抑制体外肿瘤细胞的增殖和裸鼠体内肿瘤的生长。TMEFF2是一种跨膜蛋白,EGF样和卵泡抑素样两个结构域。最近的研究表明,胃癌患者中TMEFF2明显下调,这与预后不良密切相关。这说明TMEFF2过表达可能通过与肌氨酸脱氢酶相互作用来抑制肌氨酸诱导的侵袭。在前列腺癌中的肿瘤抑制作用也已得到证实,研究人员解释说可能通过调节整联蛋白表达和RhoA激活来抑制前列腺癌细胞的迁移和侵袭。报道在神经胶质瘤TMEFF2的低表达,将其与胶质瘤患者的预后不良相关联。总体而言,已发现关于TMEFF2在人类疾病中的研究相对较少,并且在最近5年中,关于它的表达对人类肿瘤的影响的研究也很少出现,目前,尚未发现对胰腺癌进展的影响的研究。本文首先探讨TMEFF2在胰腺癌中的表达及其对胰腺癌发展的影响,旨在为胰腺癌的靶向治疗提供潜在的靶点。
   收集2016年6月至2018年9月在医院诊断为胰腺癌的72例患者,并在手术过程中收集这些患者的肿瘤组织以及邻近的正常组织。这些患者的临床信息包括年龄,性别,肿瘤大小,临床分期,远处转移和分化。该研究已获得所有患者的书面知情同意,并已得到南京医科大学附属上海市第十人民医院伦理委员会的批准,并符合《赫尔辛基宣言》。人正常胰腺导管上皮细胞系和胰腺癌细胞系购自北京协和医学院的细胞库。制备含有10%胎牛血清,100单位/mL青霉素和100ug/mL链霉素的DMEM,以在培养箱中于37°C,5%CO2的25mL无菌培养瓶中培养细胞。每两天更换一次烧瓶中的DMEM。三代后,在对数生长期收获细胞。
   通过使用DMEM,将处于对数生长期的AsPC1和Panc1细胞分别制备为单细胞悬液。将每个细胞系分别接种在6孔板中,每孔1mL细胞悬液。在37°C,5%CO2的培养箱中孵育24小时后,分别用pCDNA3.1-TMEFF2过表达载体和pCDNA3.1空载体转染每个孔中的细胞。另外,还用TMEFF2siRNA和阴性对照转染AsPC1细胞。将所有平板在37°C,5%CO2的培养箱中放置6小时条件。丢弃每个孔中的残留液体,并用含有10%FBS的新鲜DMEM代替。每个板中的所有细胞均在37°C,5%CO2的培养箱中培养48小时。将siNC组和siTMEFF2组的AsPC1细胞以每孔1×105个细胞的密度接种在6孔板中。每个孔包含1mLDMEM。将溶解在DMSO中的SB203580加入siTMEFF2组的AsPC1细胞中,使其终浓度为40uM,并将这些细胞设置为siTMEFF2+SB203580组。等效体积的DMSO还被用于处理siNC组和siTMEFF2组的AsPC1细胞,并分别命名为siNC+DMSO组和siTMEFF2+DMSO组。同时,未经处理的AsPC1细胞也接种在1孔×105的6孔板中细胞和每孔1mLDMEM。然后将溶解在DMSO中的SB203580添加到每个孔中,使SB203580的最终浓度为40uM。将所有板置于37℃,5%CO2的环境下的培养箱中。
   收获处于对数生长期的细胞,将其接种在96孔板中,每孔2×103个细胞。向每个孔中添加总共100uL含10%FBS的DMEM。每组设置六个重复的孔。将所有平板分别置于无菌培养箱中,分别在37°C,5%CO2条件下进行0、24、48和72小时的培养。每个孔中的培养基每天更换一次。在每个时间点,从培养箱中取出每组的板,并向每个孔中添加10uLCCK8溶液。然后将板放回培养箱进行1小时的培养。在450nm波长下,通过酶标仪测量每个孔的OD。每组总共5mL单细胞悬液以1×103细胞/mL的密度接种到600个培养皿中。将所有这些培养皿置于培养箱中,在37℃,5%CO2下培养2周。每三天更换培养皿中的培养基。两周后,从培养箱中取出培养皿,并使用4%多聚甲醛固定细胞15分钟。然后将细胞进行0.1%结晶紫染色10分钟。将所有培养皿置于显微镜下,并用五个不重叠的视野对每组的菌落数进行计数。超过50个细胞的聚集被视为一个菌落。将十二只裸鼠放在25°C的无菌室内,让其自由饮水和饮食。在这项研究中,所有动物实验均已获得动物伦理委员会的批准,并按照国家卫生研究院实验室的护理与使用指南进行。将NC组和TMEFF2组的AsPC1细胞悬液皮下注射到裸鼠的背部。每个细胞悬液随机注射6只裸鼠。将所有裸鼠继续在原始环境中饲养。在注射的第7、14、21、28和35天,使用游标卡尺测量皮下肿瘤的长径和短径,以/6。在第35天,处死裸鼠后收集皮下肿瘤组织并检测肿瘤重量。
   Transwell腔室的上腔室的孔径为8um,上面涂有100uLMatrigel层,以检测细胞的侵袭能力。应该注意的是,在检测细胞迁移能力时,不允许将Matrigel放置在Transwell室的上室中。使用DMEM无血清培养基,将处于对数生长期的细胞制成单细胞悬液。将总共100uL细胞悬液添加到腔室的上层。下腔室包含600uL含10%FBS的DMEM培养基。将所有Transwell腔室在37°C,5%CO2的培养箱中放置24小时。然后从培养箱中取出,并用棉签轻轻地刮除保留在腔室上膜上的细胞。甲醛用于固定穿过膜的细胞。然后对这些细胞进行结晶紫染色10分钟,并在显微镜下观察。随机选择五个非重叠区域以计算通过膜的细胞数量。将肿瘤组织固定在福尔马林中,包埋在石蜡中,并切成4微米厚的切片。使用二甲苯和梯度乙醇对所有肿瘤切片进行脱蜡和水合。使用0.01M柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复后,将切片用PBS洗涤3次,然后与3%H2O2孵育持续10分钟以去除内源性过氧化物酶活性。用山羊血清阻断切片30分钟。将小鼠抗人Ki67单克隆抗体和小鼠抗人TMEFF2单克隆抗体添加到了小鼠体内。部分。将所有切片置于冰箱中,在4°C下孵育过夜。用PBS洗涤3次后,将切片与辣根过氧化物酶标记的二抗在室温下孵育30分钟。用PBS冲洗切片3次,每次冲洗5分钟。在切片上进行DAB显色反应和苏木精复染。随后,将所有切片脱水并用中性树脂密封。
   观察到TMEFF2或Ki67阳性表达细胞,并在具有5个随机非重叠视野的显微镜下计数。具有棕黄色颗粒的细胞被认为是阳性表达细胞。将脱蜡的肿瘤组织切片与0.2%TritonX-100孵育10分钟,然后与45uLTunel测试溶液在室温黑暗中孵育1小时。用PBS洗涤3次后,在荧光显微镜下观察切片。从每个肿瘤组织中随机选择五个肿瘤切片,并随机选择每个切片的3个非重叠区域以计算Tunel阳性细胞的数目。这项研究使用qRT-PCR检测TMEFF2mRNA的表达。相信,使用RNeasymini试剂盒收集组织和细胞中的总RNA。为了获得cDNA模板,使用SuperScriptIIIFirst-Strand合成系统对总共1ug的RNA样品进行逆转录反应。PCR程序设置如下:95°C5分钟和95°C1分钟,58°C1分钟和72°C30秒的40个循环。使用ABI7300Real-TimePCR系统上的TaqMan基因表达分析来执行上述PCR程序。
   在液氮中研磨成粉末的细胞和组织在冰冷的RIPA缓冲液中裂解。通过在4℃下离心,除去不溶物和细胞碎片等杂质。获得蛋白质样品,并在100℃下用上样缓冲液煮沸。总共将80ug的每种蛋白质样品进行2小时的SDS-PAGE电泳,然后在15V的电压下转移至PVDF膜。将PVDF膜在5%脱脂奶中于室温下孵育1小时。粉末并在4°C下放置在冰箱中过夜,以与一起孵育。用TBST洗涤膜,并选择辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下将膜温育2小时。最后,通过ECL系统检测了免疫印迹信号。B-肌动蛋白用作内部对照。在本文中,所有实验均独立进行了3次。用SPSS19.0作为处理软件以平均值±SD的形式显示数据。使用学生t检验或单向方差分析分别分析两组或多个组的数据。采用Pearson的χ2检验分析胰腺癌患者的临床病理特征与TMEFF2表达之间的相关性。P<0.05表示具有统计学意义。
   检测到72例胰腺癌患者的肿瘤组织和邻近正常组织中的TMEFF2mRNA表达,与正常组织相比,在肿瘤组织中发现表达明显降低。还分析TMEFF2蛋白表达水平与患者临床特征之间的关系。可以注意到,性别,年龄和远处转移并未显着影响TMEFF2蛋白的表达。然而,肿瘤大小临床分期和分化对TMEFF2蛋白表达水平有明显影响。对于具有较大肿瘤大小,晚期且分化较差的患者,其肿瘤组织中的TMEFF2蛋白表达远高于具有较小肿瘤大小,早期以及中度和良好分化的患者。对患者的临床阶段有更详细的区分。与正常组织相比,I期患者的肿瘤组织中发现TMEFF2蛋白表达大大降低。II期患者的肿瘤组织显示TMEFF2蛋白表达明显低于I期患者。II期和III期患者在TMEFF2蛋白表达上没有发现显着差异。然而,与III期患者相比,IV期患者肿瘤组织中观察到TMEFF2蛋白表达明显降低。免疫组织化学结果还显示,随着临床分期的增加,肿瘤组织中TMEFF2阳性细胞数量逐渐减少。
   通过体外研究进一步验证TMEFF2在胰腺癌细胞中的表达,发现与人正常胰腺细胞相比,胰腺癌细胞的相对TMEFF2mRNA和蛋白质表达大大降低。导管上皮细胞。选择具有较低TMEFF2表达的AsPC1细胞和具有较高TMEFF2表达的Panc1细胞用于后续研究。转染后,TMEFF2组的AsPC1和Panc1细胞中的相对TMEFF2mRNA和蛋白表达显着低于NC组,表明细胞已成功转染。根据CCK8分析,转染72小时后,TMEFF2组中AsPC1和Panc1细胞的OD450值显着低于NC组。集落形成分析的结果表明,与NC组相比,TMEFF2组的集落数要低得多。通过皮下注射胰腺癌单细胞悬液进行裸鼠体内实验。皮下注射35d后,与NC组相比,TMEFF2组的肿瘤体积和重量明显降低。皮下肿瘤组织的免疫组织化学显示,TMEFF2组的肿瘤组织显示出比NC组高得多的阳性TMEFF2表达细胞数和明显更低的Ki67表达阴性细胞数。此外,通过Tunel测试也可检测到肿瘤组织细胞的凋亡,且Tunel+与NC组比较,TMEFF2组的肿瘤组织中的细胞数量有显着性差异。
   通过Transwell实验探讨了NC组和TMEFF2组中AsPC1和Panc1细胞的迁移和侵袭能力。与NC组的迁移和侵袭细胞数量相比,TMEFF2组明显减少。还通过蛋白质印迹法测量了两组细胞中EMT相关的蛋白质表达。与NC组相比,TMEFF2组的AsPC1和Panc1细胞中的E-钙粘蛋白相对表达显着增加。然而与NC组相比,TMEFF2组的AsPC1细胞和Panc1细胞中的相对Snail,Vimentin,MMP-2和MMP-9蛋白表达显着降低。JNK和P38是MAPK信号通路中的两个重要蛋白,MAPK信号通路的激活对肿瘤的发展有重要影响。本研究检测了NC组和TMEFF2组的AsPC1和Panc1细胞中JNK,p-JNK,P38和p-P38蛋白的表达,并计算p-JNK/JNK与p-P38/P38的比值根据测得的每种蛋白的表达水平。结果,与NC组相比,TMEFF2组的AsPC1和Panc1细胞的p-JNK/JNK和p-P38/P38比率低得多。SB203580,MAPK信号通路的抑制剂,为了研究TMEFF2是否通过影响MAPK信号通路来影响胰腺癌细胞的生物学行为,使用Medical公司的产品来处理AsPC1细胞。与siNC+DMSO组相比,siTMEFF2+DMSO组的AsPC1细胞在72小时时表现出更高的OD450值。但是,与siTMEFF2组相比,siTMEFF2+SB203580组的AsPC1细胞中的OD450值明显降低。
   集落形成分析和Transwell实验的结果表明,与siNC+DMSO组相比,siTMEFF2+DMSO组的AsPC1细胞具有明显更高的集落数以及迁移和侵袭细胞数。但与siTMEFF2+DMSO组相比,在siTMEFF2+SB203580组的AsPC1细胞中发现明显减少的菌落数以及迁移和侵袭细胞数。此外,与siNC+DMSO组相比,siTMEFF2+DMSO组的AsPC1细胞中E-cadherin蛋白表达低得多,Snail,Vimentin,MMP-2和MMP-9蛋白表达明显升高。E-钙粘蛋白蛋白表达显着较高,而表达则低得多。研究TMEFF2表达对Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的影响,可以发现,与NC组相比,TMEFF2组的AsPC1和Panc1细胞中Ras,p-Raf/Raf,p-MEK/MEK,p-ERK/ERK的表达明显降低。众所周知,Ras/Raf/MEK/ERK信号通路参与包括胰腺癌在内的多种肿瘤的发生。因此可以得出结论TMEFF2通过干扰Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的磷酸化来抑制胰腺癌的进展。
   在过去的几十年中,分子靶向治疗已成为临床肿瘤学研究的热点,并且有望在将来找到一些有效的潜在治疗靶点来完全治愈人类肿瘤。胰腺癌是一种常见的恶性肿瘤,会给患者带来严重的预后不良,并且已经出现一些潜在的胰腺癌分子治疗靶标。在这项研究中,使用蛋白质印迹和免疫组织化学检测胰腺癌患者肿瘤组织中TMEFF2蛋白的表达,并发现TMEFF2蛋白表达下调与不良预后有关。TMEFF2的过表达可以抑制胰腺癌细胞的体外增殖和体内生长。对人肿瘤中TMEFF2的一些现有分析表明,TMEFF2是抑癌基因,它可以抑制前列腺癌细胞的生长。幽门螺杆菌诱导的胃癌细胞中TMEFF2的表达明显降低,而TMEFF2的过表达可能与幽门螺杆菌有关。通过负调节STAT3的磷酸化诱导胃癌发生。数据还显示,TMEFF2在胰腺癌中是一种肿瘤抑制因子。据我们所知,这是TMEFF2在胰腺癌中的首次研究。另外根据免疫组织化学,TMEFF2过表达抑制裸鼠移植的肿瘤组织中Ki67的表达水平。Ki67是一种广泛认可的细胞增殖标志物,可通过影响细胞有丝分裂来调节细胞周期,从而促进肿瘤细胞的增殖和生长。
   在EMT过程中,上皮来源的恶性细胞将被转化为更具迁移性和侵入性的间质细胞,从而极大地促进了肿瘤的恶性发展。EMT的主要特征是细胞之间的粘附力下降,细胞桥粒和半桥粒的破裂,细胞极性的丧失,基质金属蛋白酶的分泌以及细胞外基质的降解,这使肿瘤细胞获得了更大的运动能力以及更大的迁移和侵袭空间。E-cadherin,Snail,Vimentin,MMP-2和MMP-9蛋白都是与EMT相关的蛋白,在EMT的发生中起着不可替代的作用。EMT的主要标志是E-钙粘蛋白表达的下降,Snail与E-钙粘蛋白启动子上的E-box元件结合以抑制E-钙粘蛋白的转录,从而导致肿瘤细胞之间的粘附力丧失和能力增强。入侵和转移。波形蛋白是中间纤维的主要成分,其高表达已被证实可以增强肿瘤细胞的侵袭能力。基质金属蛋白酶家族的成员MMP-2和MMP-9可以通过降解IV,V型胶原蛋白和各种基质成分破坏基底膜,从而使肿瘤细胞浸润并转移到人体其他部位。来自本文的数据表明,TMEFF2的过表达通过抑制EMT来减弱胰腺癌细胞的迁移和侵袭。在TMEFF2过表达后,在胰腺癌细胞中发现E-钙粘蛋白蛋白表达上调而Snail,Vimentin,MMP-2和MMP-9蛋白表达下调。
   据报道,MAPK信号传导途径参与各种人类肿瘤的发展。在这项研究中,我们注意到TMEFF2的上调可以显着抑制胰腺癌细胞中JNK和P38的磷酸化。JNK和P38是MAPK信号通路的两个重要组成部分,它们的磷酸化极大地促进肿瘤的发展。先前的研究还表明,JNK和P38的磷酸化促进了胰腺癌细胞的增殖,迁移和侵袭。现有文献记载,TMEFF2可以通过调节重要的信号传导途径,如AKT,ERK和CRH信号通路参与人类疾病发展的调节。这是首次发现TMEFF2通过抑制MAPK信号通路的磷酸化来抑制胰腺癌细胞的增殖,迁移和侵袭。此外还发现TMEFF2过表达抑制胰腺癌细胞中Ras/Raf/MEK/ERK信号通路的磷酸化,信号传导途径是MAPK途径中最经典的途径之一,它广泛参与细胞生物学行为的调控,并与肿瘤细胞的恶性表型密切相关。在激活信号通路后,Ras,p-Raf,p-MEK和p-ERK蛋白的表达增加,导致细胞周期蛋白表达增加,CDK-Cyclin复合体水平升高。然后将细胞从G0/G1期诱导到S期,从而促进细胞周期的进程。先前的研究还表明,抑制Ras/Raf/MEK/ERK信号通路活性可能会阻碍胰腺癌的进展。数据还表明,TMEFF2可能通过与RAS/RAF/MEK/ERK信号传导途径的磷酸化干扰抑制胰腺癌的进展。
   该研究存在局限性。应该研究每个细胞系的更完整的基因型和表型,并且还应该探索是否取决于TP53突变状态的TMEFF2表达。但是,由于实验室条件的限制,我们目前无法对此进行深入研究,这将是我们未来研究的重点。简而言之,这项研究发现TMEFF2在胰腺癌中显着下调,而TMEFF2表达低显然与胰腺癌患者预后差有关。更重要的是,TMEFF2的过表达可能通过抑制MAPK信号通路的磷酸化来抑制胰腺癌细胞的增殖,迁移和侵袭。随着未来更多相关研究的出现,TMEFF2有望成为治疗胰腺癌的有效靶标。

 
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  由著名肿瘤医学家、首届“国之名医—卓越建树奖”获得者夏廷毅教授担任医学总顾问;著名放射肿瘤物理学家、中国肿瘤放疗事业特殊贡献奖获得者张红志教授担任物理技术总顾问,领率国家一大批肿瘤放疗专家和物理师组建专业团队,聚焦精准放疗,整合多学科资源,通过专家下沉基层开展医疗技术服务,助推肿瘤精准放射医学产、学、研、用全链条一体化发展,全面提高全国各地肿瘤病人精准放疗可及性和综合治疗水平,最大限度满足肿瘤患者就地就近享受高水准、高质量人性化诊疗服务。
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