胰腺癌
 
胰腺癌
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胰腺癌信息  

胰腺癌患者预后较差

  胰腺癌是一种高度致死性的恶性肿瘤,其5年生存率低于5%,其特点是早期转移,快速浸润和对标准疗法的耐药性。胰腺导管腺癌是最常见的形式,占所有胰腺癌病例的90%以上。根治性切除是成功的胰腺癌治疗的核心,但是只有15-20%的患者在可以进行手术切除的癌症早期被诊断出。在就诊时,大部分患者被诊断出患有局部晚期或转移性癌症。尽管近年来已经取得越来越多的疗法,包括化学疗法,放射疗法和分子疗法,但是胰腺癌患者的总体5年生存率仍不到7%。在过去的几十年中,尽管已经说明几种与胰腺癌的发生有关的危险因素,但在胰腺癌进展的分子机制上进展甚微。因此,鉴定涉及胰腺癌进展的新型生物标志物对于提供早期诊断和开发有效的治疗选择是必要的。
   微小RNA是一类小的非编码RNA,通过与信使RNA的3′-非翻译区直接结合来抑制基因表达。在过去的十年中,已经广泛检查miRNA在癌变过程中的失调,这与肿瘤的发生,转移和复发密切相关。变化的miRNA表达模式已被链接到在胰腺癌肿瘤细胞表型产生深远的影响。例如miR-10a-5p调节转录因子AP-2γ以促进胰腺癌的吉西他滨耐药性。MiR-148a通过靶向Wnt家族成员10B抑制胰腺癌细胞的上皮-间质转化和侵袭。MiR-337靶向同源盒B7,以抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭。此外,miR-181b-5p,ETS原癌基因1和MET原癌基因信号通路加剧了放疗后胰腺癌患者的不良预后。
   作为成熟miR-27a的同工型,MiR-27a-3p位于人染色体19p13上,并且已发现其经常异常表达并有助于多种类型的癌症中的肿瘤进展。使用来自三个独立队列的HiSeq2000测序,确定血清CA19-9和外周血单核细胞的miR-27a-3p水平的组合可将胰腺癌与良性肿瘤区分开胰腺疾病。推测miR-27a-3p在胰腺癌中具有重要的血管生成活性。然而,miR-27a-3p在胰腺癌中的生物学作用和潜在机制仍有待阐明。在这项研究中,检测miR-27-3p在胰腺癌组织和细胞系中的表达模式,并确定miR-27a-3p在胰腺癌细胞体外迁移和血管生成中的生物学作用。我们进一步确定了miR-27a-3p在其靶基因GATA6上在胰腺癌的迁移和血管生成中的潜在机制,这可能揭示它们在这些癌症治疗中的靶向应用。医院普外科进行根治性手术切除或活检后,于2006年1月至2014年6月收集28对新鲜的胰腺癌组织及其相应的非肿瘤组织。胰腺癌患者均未接受任何术前和术后化疗和放疗。所有标本均已被病理学家基于苏木精-曙红和免疫组化染色确诊。该研究得到医院伦理委员会的批准。为了将这些临床材料用于研究目的,所有患者均签署同意书,并按照1964年赫尔辛基宣言的规定进行。从每位患者收集临床数据,包括年龄,性别,肿瘤大小,肿瘤分化,临床分期,位置,淋巴结转移,血管浸润和腹膜转移。切除后,立即将组织标本冷冻在液氮中以进行后续分析。
   正常人胰管上皮细胞系和胰腺癌细胞系获自中国科学院上海生物科学研究所细胞库。这些细胞在补充了15%胎牛血清,100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素的Dulbecco's改良的Eagle's培养基中培养。将所有电池保持在37°C的5%CO2湿润的气氛中。miR-27a-3p抑制剂和抑制剂加扰对照,miR-27a-3p模拟物和模仿物加扰对照以及GATA6小干扰RNA和siRNA对照购自GeneCopoeiaCompany。通过使用Lipofectamine2000根据制造商的方案进行细胞转染。将AsPC-1和Panc-1细胞培养在12孔板中,并用等量miR-27a-3p抑制剂和抑制剂加扰的对照,或miR-27a-3p模拟物和模仿加扰的对照瞬时转染,并在某些情况下与2ugGATA6siRNA和siRNA对照一起使用。转染后48小时,收集转染的细胞用于实时定量PCR分析。根据制造商的说明,使用TRIzol试剂分离总RNA。然后使用Omniscript反转录试剂盒将RNA样品反转录为cDNA。通过使用QuantitectSyBrgreenPCR系统进行实时定量PCR反应。RNAU6BsnRNA和3-磷酸甘油醛脱氢酶分别用作miRNA和mRNA内部对照。
   通过伤口愈合试验确定miR-27a-3p对胰腺癌细胞迁移的影响。简而言之,将AsPC-1和Panc-1细胞以60%的融合度接种到6孔板中,并孵育过夜。转染后24小时,使用无菌100uL针尖在单层上形成人工伤口。刮擦后,将漂浮细胞用磷酸盐缓冲盐水洗涤3次,并用新鲜的无血清培养基代替培养基。在Zeiss倒置光学显微镜下在0和12小时的时间点以×或100或200放大倍数捕获细胞迁移的图像。进行体外毛细管形成测定以评估miR-27a-3p对血管生成的作用。简而言之,将200uLMatrigel添加到24孔板的每个孔中,并使其在37°C下聚合30分钟。在进行毛细管形成测定之前,对于血清饥饿的人脐静脉内皮细胞,将细胞在含1%微血管生长补充剂的MCDB131培养基中孵育。在37°C下放置8小时。然后,HUVEC在37°C的涂板中于肿瘤细胞衍生的培养基中生长。6小时后在倒置光学显微镜下对细胞照相以评估毛细管状结构的形成。分支的数量代表体外血管生成的程度。
   通过将人GATA6的扩增的3′-UTR插入pmirGLO荧光素酶报道质粒中,构建GATA63′-UTR-野生型载体。随后,将与miR-27a-3p“种子”相互作用的结合序列从ACUGUGA突变为A--A,并将突变体GATA63′-UTR插入pmirGLO荧光素酶报道质粒中。构建GATA63′-UTR-mutant载体。然后,将GATA63+-UTR-WT或MUT载体和等量的miR-27a-3p抑制剂,抑制剂加扰的对照,miR-27a-3p模拟物和模拟加扰的对照共转染到AsPC-1和Panc-1细胞使用Lipofectamine2000。转染后48小时,使用Dual-LuciferaseReporterAssay系统使用BCA蛋白质测定试剂盒对蛋白质进行定量。通过10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质,然后将其印迹到PVDF膜上。将膜用5%脱脂牛奶在37°C下封闭2小时,然后与抗GATA6抗体一起孵育,抗体,抗VEGFR2抗体和抗GAPDH抗体在4°C下过夜。用Tris-缓冲盐水和Tween20洗涤3次后,将膜与抗兔或小鼠二抗在37°C下放置1小时。最后将40:1的过氧化物:鲁米诺溶液添加到膜中,并在37°C下孵育5分钟。捕获信号并使用Bio-RadChemidocXRS凝胶成像系统对条带强度进行定量。使用SPSS17.0统计软件包进行统计分析。使用的miR-27A-3P表达和临床病理特征之间的关联进行评价χ2测试。使用Kaplan–Meier方法和对数秩检验分析生存数据。使用带有Bonferroni校正或Studentt检验的单向方差分析来分析各组之间的差异。所有数据代表三个独立实验的平均值,并且显着差异表示为P<0.05。
   为了检查miR-27a-3p在胰腺癌样品中的表达模式,在28对配对的胰腺癌组织及其相应的非肿瘤组织中进行了定量实时PCR分析。结果表明,与相应的非肿瘤组织相比,miR-27a-3p在胰腺癌组织中的表达显着增加。在大多数情况下,肿瘤组织中的miR-27a-3p表达明显高于非肿瘤组织中的表达。此外与胰腺癌样品的结果一致,与正常细胞相比在两个胰腺癌细胞系中也发现miR-27a-3p的表达水平显着上调。人胰导管上皮细胞系。总体而言,这些数据表明miR-27-3p在胰腺癌组织和细胞系中经常过表达。使用卡方检验进一步检查胰腺癌患者中miR-27a-3p表达与临床病理特征之间的关联。胰腺癌组织中miR-27a-3p的平均表达水平用作临界值;在胰腺癌的28个样本中,分别将12个样本和16个样本分为高和低miR-27a-3p表达组。高miR-27a-3p表达与更多的淋巴结转移和目前的腹膜转移。miR-27a-3p表达与其他临床病理参数之间无统计学意义的关联。此外,通过Kaplan–Meier方法和对数秩检验评估了miR-27a-3p表达的预后价值,发现高表达的miR-27a-3p与胰腺癌患者的不良预后密切相关。总之这些结果为胰腺癌中miR-27a-3p的潜在转移作用和预后不良提供提示。
   为了评估miR-27a-3p对胰腺癌转移的潜在作用,我们将miR-27a-3p抑制剂或抑制剂加扰控制引入AsPC-1和Panc-1细胞,同时用miR-27a-p转染细胞。3p模拟或模拟加扰控制。实时荧光定量PCR检测数据证实,转染的miR-27a-3p抑制剂可显着降低AsPC-1和Panc-1细胞中miR-27a-3p的表达水平,而胰腺癌用miR-27a-3p模拟物处理的细胞比用模拟物加扰对照转导的细胞具有更高的miR-27a-3p水平。随后,在胰腺癌细胞中进行伤口愈合分析,数据显示miR-27a-3p的过表达显着增加AsPC-1和Panc-1细胞的体外迁移。然而,胰腺癌细胞的迁移能力被miR-27a-3p抑制剂显着阻断。简而言之,这些结果表明miR-27a-3p促进了胰腺癌细胞的迁移能力。血管生成是癌症的标志,许多研究已经证明血管生成在促进肿瘤转移中的重要作用。因此试图探讨miR-27a-3p是否对血管生成有促进作用。HUVEC被用作内皮细胞的来源,以进行体外毛细管形成测定。首先,将miR-27a-3p模拟或模拟加扰对照和miR-27a-3p抑制剂或抑制剂加扰对照转染到HUVEC中,以检查管形成的变化。与模仿的对照组相比,miR-27a-3p的过表达显着提高了管的形成能力,而miR-27a-3p抑制剂则减少管的形成。由于VEGFA/VEGFR2途径在生理和病理学上均在血管生成中起着关键作用,因此转染miR-27a-3p模拟物和抑制剂后,检测AsPC-1和Panc-1细胞中VEGFA和VEGFR2的表达水平。数据显示,miR-27a-3p的过表达上调VEGFA和VEGFR2的蛋白表达水平,而miR-27a-3p的敲低则下调VEGFA和VEGFR2的表达。结果表明,miR-27a-3p通过激活VEGFA/VEGFR2信号传导途径促进胰腺癌细胞的血管生成。
   为了阐明miR-27a-3p在胰腺癌转移中的潜在机制,预测使用TargetScan和PicTar计算机,miR-27a-3p的“种子”序列可以完全结合GATA63-UTR序列的ACUGUGA。辅助算法。然后,分析28个胰腺癌样品中GATA6mRNA水平与miR-27a-3p表达之间的相关性。在胰腺癌样品中发现GATA6mRNA水平与miR-27a-3表达之间显着负相关。进一步的研究表明,用miR-27a-3p模拟物转染AsPC-1和Panc-1细胞与模拟对照处理的细胞相比,显着降低了GATA6的mRNA和蛋白质表达水平,而用miR-27a-3p抑制剂转染可显着提高AsPC-1和Panc-1细胞中GATA6表达的水平。为了鉴定miR-27a-3p是否可以直接靶向GATA6表达,进行荧光素酶报告基因检测。构建含有GATA63或MUT序列的荧光素酶报告质粒,以验证GATA6和miR-27a-3p之间的结合位点。将AsPC-1和Panc-1细胞与GATA63-UTR-WT或MUT载体,miR-27a-3p模拟或模拟加扰对照以及miR-27a-3p抑制剂或抑制剂加扰对照共转染时,数据显示与模拟对照相比,miR-27a-3p模拟物显着下调胰腺癌细胞中GATA63-UTR-WT载体的相对荧光素酶活性,但不包括GATA63-UTR-MUT载体。相反与抑制剂加扰对照相比,在胰腺癌细胞中转染miR-27a-3p抑制剂后,GATA63-UTR-WT载体的相对荧光素酶活性明显增加,但不影响GATA63-UTR。MUT向量。这些观察结果表明,GATA6是miR-27a-3p的靶基因,而miR-27a-3p直接靶向GATA6以下调胰腺癌细胞中内源性GATA6的表达。
   为了检验miR-27a-3p/GATA6/VEGFA/VEGFR2信号通路参与胰腺癌细胞的转移和血管生成的假设,将GATA6siRNA或siRNA对照转染到胰腺癌细胞中以敲低GATA6的表达。结果显示,用GATA6siRNA转染的AsPC-1和Panc-1细胞比用siRNA对照处理的细胞表现出更低的GATA6蛋白表达。有趣的是,GATA6siRNA可以降低用miR-27a-3p抑制剂处理过的AsPC-1和Panc-1细胞中GATA6的蛋白表达。值得注意的是,用GATA6siRNA转染的miR-27a-3p抑制剂处理过的AsPC-1和Panc-1细胞的细胞迁移和管形成能力明显更高。细胞与miR-27a-3p抑制剂和siRNA对照共转染。此外,在敲除GATA6后,miR-27a-3p抑制剂处理的AsPC-1和Panc-1细胞中VEGFA和VEGFR2的蛋白表达水平部分逆转。因此研究表明,miR-27a-3p的上调通过表观遗传性的GATA6沉默和激活VEGFA/VEGFR2信号通路来促进胰腺癌的细胞血管生成和迁移。
   越来越多的研究表明,miRNA的异常表达有助于胰腺癌的发生和发展。一些miRNA与胰腺癌细胞的转移能力有关。下调的miR-98-5p通过下调MAP4K4和抑制下游MAPK/ERK信号传导来促进胰腺癌细胞的增殖和转移。miR-107的表达失调通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制胰腺癌细胞的转移。miR-448通过靶向JAK1/STAT3信号通路抑制胰腺癌细胞的转移。miR-454通过靶向LDL受体相关蛋白6来抑制胰腺癌细胞的肿瘤增殖,血管生成和转移。然而,miR-27a-3p的生物学功能和潜在机制可能是通过抑制LDL受体相关蛋白6来实现的。MiR-27a-3p是miR-23a27-24a集群的成员。最近的研究表明,miR-27a-3p在包括骨肉瘤,结直肠癌,鼻咽癌和胃癌在内的几种转移性肿瘤中经常被上调,并有助于肿瘤的进展和转移。为证实胰腺癌中miR-27a-3p表达的特征,通过实时PCR分析检查28对配对的胰腺癌样品中miR-27a-3p的表达。与非肿瘤组织和正常人胰管上皮细胞系相比,胰腺癌组织和细胞系中的miR-27a-3p水平显着上调,并且高miR-27a-3p表达与更多的淋巴结相关转移,目前腹膜转移和预后不良。数据与文献的以往的作品表示几个转移性肿瘤的miR-27A-3P的上调线,不仅证实miR-27a-3p的过表达模式,而且还暗示miR-27a-3p在胰腺癌进展中的重要转移功能和不良预后。
   至于miR-27a-3p在转移性肿瘤中的作用,miR-27a-3p的过表达促进体内外胃癌细胞的迁移。MiR-27a-3p抑制抑制骨肉瘤细胞的恶性表型。结果表明,miR-27a-3p的过表达显着促进胰腺癌细胞的迁移并诱导HUVEC的体外血管生成。发现miR-27a-3p敲低可减少体外迁移和血管生成。血管生成是肿瘤进展的基本过程,并且肿瘤细胞可以产生许多生长因子来调节血管生成。有证据表明,VEGFA/VEGFR2途径在调节血管生成中起关键作用。VEGFA通过结合其受体以旁分泌/自分泌的方式诱导生物学作用。在当前的研究中,还发现miR-27a-3p通过激活VEGFA/VEGFR2信号通路促进胰腺癌细胞的血管生成,而miR-27a-3p的阻断通过抑制VEGFA/VEGFR2表达来减少血管生成。数据提供大量证据,证明miR-27a-3p促进胰腺癌细胞的迁移和血管生成。
   由于miRNA通过调节靶基因的表达来执行其生物学功能,因此鉴定miR-27a-3p的靶基因对于阐明miR-27a-3p在胰腺癌细胞转移中的潜在机制很重要。据报道有几种基因可能作为miR-27a-3p的潜在靶标,包括MAX相互作用蛋白1二聚体蛋白,含F-box和WD重复域的7,钙黏着蛋白5和B细胞易位基因2。GATA6是进化上保守的锌指转录因子家族的成员,该家族成员与GATA共有序列结合以激活或抑制基因表达,该基因表达在几种类型的癌症中异常表达并根据肿瘤起源起癌基因或抑癌作用。根据小部分肿瘤中GATA6增益的发生,有人提出GATA6在胰腺癌中的致癌作用,而胰腺癌小鼠模型中则假定了GATA6的肿瘤抑制作用。最近提供机械洞察胰腺癌GATA6的肿瘤抑制功能。GATA6是规范性上皮细胞分化的调节剂,而GATA6表达的丧失既是对辅助治疗反应的预后又是预测性的。重要的是,目前在胰腺癌样品中的分析还发现,GATA6mRNA水平与miR-27a-3p表达呈负相关。这些结果与马蒂内利的报告是一致的。
   此外,生物信息学分析表明,GATA6在理论上可能是miR-27a-3p的潜在靶标,而GATA6mRNA3+-UTR具有假定的miR-27a-3p结合位点。由于miRNA通常通过结合靶mRNA的3′-UTR来负调控基因表达,因此推测miR-27a-3p可能能够通过mRNA3′-UTR中的结合位点抑制GATA6表达。基于荧光素酶报告基因测定,我们证实miR-27a-3p直接与胰腺癌细胞中GATA6mRNA的3′-UTR区结合。此外,检测到AsPC-1和Panc-1细胞中miR-27a-3p水平改变后GATA6的内源表达。如预期的那样,在敲低miR-27a-3p之后,GATA6表达的mRNA和蛋白质表达水平显着增加,以上数据表明,miR-27a-3p直接靶向GATA6,以下调胰腺癌细胞中内源性GATA6的表达。这些研究鼓励我们假设miR-27a-3p可能通过下调GATA6发挥其转移作用。在miR-27a-3p抑制剂治疗的胰腺癌细胞中发现GATA6siRNA降低GATA6的表达。救援实验提供的证据表明,用GATA6siRNA转染的miR-27a-3p抑制剂处理的AsPC-1和Panc-1细胞表现出明显更高的细胞迁移能力和管形成能力。此外,通过miR-27a-3p抑制剂,GATA6敲低逆转AsPC-1和Panc-1细胞中VEGFA和VEGFR2的蛋白表达水平。
   结果表明,miR-27a-3p/GATA6/VEGFA/VEGFR2信号通路负责胰腺癌细胞的迁移和血管生成。但应该提到的是,miR-27a-3p还可下调GATA6以外的靶基因。因此,miR-27a-3p介导的转移作用在胰腺癌中是否还有其他信号通路需要进一步研究。总之发现表明miR-27a-3p在胰腺癌中上调,而miR-27a-3p促进胰腺癌细胞的迁移和血管生成。GATA6作为miR-27a-3p靶向基因在胰腺癌转移过程中在VEGFA/VEGFR2信号通路的激活中起关键作用。这些观察结果凸显了研究miR-27a-3p在胰腺癌治疗中的治疗益处的基本原理。

 
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  由著名肿瘤医学家、首届“国之名医—卓越建树奖”获得者夏廷毅教授担任医学总顾问;著名放射肿瘤物理学家、中国肿瘤放疗事业特殊贡献奖获得者张红志教授担任物理技术总顾问,领率国家一大批肿瘤放疗专家和物理师组建专业团队,聚焦精准放疗,整合多学科资源,通过专家下沉基层开展医疗技术服务,助推肿瘤精准放射医学产、学、研、用全链条一体化发展,全面提高全国各地肿瘤病人精准放疗可及性和综合治疗水平,最大限度满足肿瘤患者就地就近享受高水准、高质量人性化诊疗服务。
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