胰腺癌是最致命的实体瘤之一。全球癌症统计数据表明，2018年美国将发生约53,070例新的胰腺癌病例，其5年生存率仅为1.2％–6％。目前建议手术切除作为一线治疗。但当疾病处于晚期并且已经过根治性切除的机会时，诊断出具有非特异性症状的胰腺癌患者中>80％。因此，放疗和化疗在胰腺癌的治疗中起着至关重要的作用。尽管现代影像引导技术已经改善放疗，但放疗的功效仍然受到肿瘤细胞内在和外在辐射耐受性的限制。为了提高胰腺癌细胞的放射敏感性以及患者的预后，迫切需要阐明胰腺癌中放射抗性的分子机制。肿瘤微环境在肿瘤发生和治疗抗性中起关键作用。肿瘤内缺氧是肿瘤微环境中广泛观察到的特征，并已显示出其在许多实体瘤中对辐射抗性的贡献。缺氧是胰腺癌的突出生物学特性，通过在胰腺癌的区域氧的较低分压所证明与正常胰腺组织相比。
　　 低氧诱导因子调节肿瘤细胞适应低氧微环境所需的基因表达。HIF家族包括HIF-1a，HIF-2a和HIF-3a。HIF-1a的过表达增强癌细胞的增殖，代谢，侵袭和转移。凋亡的逃避是癌细胞的标志，并且已经显示出HIF-1a可以阻止肿瘤细胞凋亡，从而导致放射抗性。HIF-1a抑制内在的细胞凋亡途径。HIF-1a是EGFR介导的途径的下游因素，是肿瘤微环境和放射抗性的重要调控成分。EGFR的异常活性可促进癌前病变和胰腺导管腺癌的形成。这种类型的异常变化的，同时，导致增强的增殖和胰腺癌细胞的侵袭。缺氧是肿瘤放射抵抗的最重要因素之一。胰腺癌细胞适应缺氧并通过HIF-1a依赖性机制保持活力。由于胰腺癌特定肿瘤微环境中的低氧条件，这些组织中HIF-1a的表达明显高于其他实体瘤。因此，HIF-1a可能在胰腺癌和相关的血管生成的肿瘤发生中起关键作用。HIF-1被脯氨酸羟化酶结构域和抑制因子HIF-1降解。PHD系列包括PHD1，PHD2和PHD3。在体外研究表明，所有的博士能羟化HIFs。但已为不同的PHD确定HIF的不同羟基化位点。虽然PHD2是HIF-1a在常氧和缺氧时细胞的复氧的主要监管机构，PHD3可能调节更为严重，长时间缺氧HIFs。HIF-1a通过经由希佩尔-林道博士识别并通过泛素-蛋白酶体系统降解。PHD1和PHD2可以使C端羟基化位点Pro564和N端羟基化位点Pro402羟基化；但是，PHD3只能将C末端的羟基化位点Pro564羟基化，而在N末端的Pro402位点则没有活性。因此，博士可以抑制HIFs的低氧条件下的蛋白质表达并提高肿瘤细胞的耐受低氧条件的能力。先前的研究表明，PHD3是在胰腺癌细胞低氧微环境中降解HIF-1a的限速酶。然而，PHD3的对胰腺癌细胞的放射线治疗功效的效果是未知的。在本研究中调查PHD3过表达对胰腺癌细胞放射治疗效果的影响及其潜在的分子机制。
　　 DMEM购自Hyclone。FBS购自Gibco。膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素和碘化丙啶购自eBioscience。抗EGFR，抗p-EGFR，抗PHD3和抗HIF-1a抗体购自Abcam。人胰腺腺癌Mia-paca2细胞购自中国科学院上海生物科学研究所干细胞生物学重点实验室。将细胞在DMEM中培养在补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素和保持在含有10％CO的潮湿培养箱2，20％或2％氧气2在37℃下。通过短串联重复序列分析验证了细胞系。将细胞在25cm2细胞培养瓶中培养至对数生长期，并使用ElektaPrecise线性加速器以高能量辐射对2、4、6或8Gy进行单次照射X射线。照射距离为100cm，照射野为15×15cm。在培养箱中恢复48小时后进行后续实验。293T细胞与慢病毒载体，pGag/Pol，pRev和pVSV-G的质粒以及带有PHD3基因的质粒共转染。48小时后，收获含有包装病毒的培养基。将处于对数生长期的Mia-paca2细胞接种到6孔细胞培养板中，并用病毒上清液进行培养。24小时后更换培养基，并将感染的细胞进行进一步的实验。
　　 将细胞以300个细胞/孔的密度接种到6孔板中。用新鲜培养基替换培养基12小时后，用不同剂量的单个级分照射细胞，并每3天更换培养基培养3周。用PBS漂洗细胞两次，用4％多聚甲醛固定15分钟，并用0.4％结晶紫溶液染色30分钟。在低倍显微镜下计数克隆的数量。种植效率和存活率的计算如下：PE＝×100％。SF=×100％。用一式三份的样品重复实验三次。在冰上用包含苯基甲烷磺酰氟的放射免疫沉淀测定裂解缓冲液处理细胞30分钟，然后在12,000rpm和4°C下离心5分钟。将上清液转移到新的试管中，并通过二辛可宁酸蛋白质测定法测定蛋白质浓度。通过10％十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离总计30ug的每种蛋白质样品，并将其转移到聚偏二氟乙烯膜上。在室温下，用含0.05％Tween20的Tris缓冲盐水中的5％脱脂牛奶将膜封闭1小时，然后与主要抗PHD3，抗HIF-1a，抗EGFR，抗p-EGFR或抗B-actin抗体在4°C过夜。用TBST洗涤3次后，在室温下，将膜与缀有辣根过氧化物酶的小鼠或兔二抗孵育1小时。通过化学发光使特定的蛋白条带可视化。处理后，处理细胞以获得单细胞悬液，并用冰冷的PBS洗涤两次，然后与100uL含5uLPI和5uLAnnexinV-FITC的结合缓冲液在室温下于黑暗中孵育15分钟。加入400uL结合缓冲液后，通过流式细胞术对细胞进行细胞凋亡和周期分布分析。使用SPSS软件分析所有数据。结果表示为平均值±标准误差。各组之间的比较通过Student'st检验进行检验。P<0.05被认为具有统计学意义。
　　 为了评估PHD3是否调节EGFR/HIF-1a途径的活性，胰腺癌治疗网进行蛋白质印迹实验，以评估慢病毒介导的PHD3过表达对2种Gy照射后两种情况下EGFR，p-EGFR和HIF-1a表达的影响。常氧或低氧状况。与阴性对照组相比，慢病毒介导的过表达增加PHD3蛋白水平。在常氧条件下并用2Gy辐射治疗，PHD3过表达对总EGFR表达无明显影响，但明显降低p-EGFR和HIF-1a的表达。接下来，胰腺癌治疗网在缺氧条件下培养正常和PHD3过表达的细胞，然后用2Gy辐射处理。与照射的正常细胞相比，在过表达PHD3的细胞中HIF-1a和p-EGFR的表达水平被显着抑制，而在EGFR表达上没有显着差异。有趣的是还发现，在常氧或低氧条件下，Mia-paca2细胞中的辐射略微促进了PHD3的表达水平，并伴随着HIF-1a和p-EGFR表达的降低。此外，在常氧或低氧条件下，单独的PHD3过表达都会导致HIF-1a和p-EGFR表达显着下降。这些结果表明，在常氧和低氧条件下，Mia-paca2细胞中EGFR/HIF-1a途径的激活与PHD3表达相关。
　　 为了研究PHD3表达的增加是否影响暴露于放射治疗的Mia-paca2细胞的集落形成能力，进行集落形成分析。在常氧或低氧条件下，经2G，4G或6Gy辐射处理的正常和PHD3过表达细胞的SF显着低于未辐照的细胞。然而，当在常氧条件下用8Gy辐射处理细胞时，正常和过表达PHD3的细胞之间的SF没有显着差异。相反，在缺氧条件下，PHD3的过表达显着增强细胞活力的丧失。这些结果表明，PHD3的过表达可以显着抑制在低氧或低氧条件下用低剂量辐射处理的Mia-paca2细胞的集落形成能力。PHD3的过表达不会改变在高氧条件下用高剂量辐射处理的Mia-paca2细胞的增殖，但会抑制其在低氧条件下的生存能力。为了检查PHD3是否通过调节Mia-paca2细胞中的EGFR/HIF-1a途径参与细胞凋亡，胰腺癌治疗网在常氧或低氧条件下培养正常和过表达PHD3的细胞，有或没有暴露于2Gy辐射。通过膜联蛋白V-FITC/PI染色结合流式细胞术分析细胞凋亡。在常氧条件下，PHD3过表达细胞的凋亡率明显高于正常细胞。照射显着增加了正常细胞的凋亡率，PHD3过表达进一步增加照射2Gy的细胞的凋亡率。当细胞在低氧条件下进行处理，凋亡率与该含氧量正常条件下。这些结果表明，PHD3过表达增加了放射诱导的Mia-paca2细胞凋亡，在低氧条件下效果更佳。
　　 为了评估PHD3在Mia-paca2细胞的细胞周期进程中的作用，在常氧或低氧条件下培养正常和过表达PHD3的细胞。通过PI染色和流式细胞仪进行细胞周期分布分析。在常氧和低氧条件下，与该阶段未处理的正常细胞的百分比相比，PHD3的过表达或辐射处理导致G2/M期的细胞百分比显着增加。此外，与前三组相比，用2Gy辐射处理的过表达PHD3的细胞中G2/M期的细胞百分比显着增加。因此，PHD3的过表达导致细胞周期停滞在G2/M期，这通过放射治疗得以增强。在大多数胰腺癌放射治疗临床试验中，局部控制率在49％至100％之间。肿瘤微环境已显示出可抑制放疗在胰腺癌中的疗效。先前的研究表明，肿瘤内缺氧具有侵袭性和转移性，与放射疗法的抵抗力有关。在本研究中发现，通过抑制肿瘤细胞的缺氧的耐受性改变的细胞的生物学特性能增强胰腺癌细胞的放射线治疗的功效。
　　 HIF-1a是一种必需的转录因子，可在细胞中介导低氧适应性反应并在低氧条件下维持癌细胞的克隆形成性。HIF-1a是EGFR介导的信号传导途径的下游因子，肿瘤微环境和辐射抗性的必需调控元件。在HIF-1a和EGFR信号之间存在一个正反馈回路。HIF-1a的下调可以进一步刺激EGFR/细胞外调节蛋白激酶通路，从而潜在地降低由低氧条件导致的EGFR/MAP激酶–ERK激酶/ERK/HIF-1a环的级联扩增。在这里，胰腺癌治疗网的数据显示PHD3调节EGFR/HIF-1a途径的活性，这是在常氧或低氧条件下过表达PHD3时HIF-1a和p-EGFR的表达降低所证明的。有趣的是观察到在用2Gy辐射处理的过表达PHD3的细胞中，HIF-1a和p-EGFR的抑制作用明显更强。因此，PHD3的上调可能会增强辐射诱导的EGFR/HIF-1a途径的抑制作用。据报道，PHD3可以限制肿瘤发生过程中EGFR的激活。此外，之前的研究已经表明，照射介导的细胞内信号传导途径的激活可以增强肿瘤坏死因子a在髓核细胞表达，这反过来又进一步上调PHD3的在表达水平核因子-kB依赖性方式。胰腺癌治疗网发现，22Gy辐射增加PHD3在MIA-paca2细胞，这与先前的研究结果相一致的表达。因此，辐射介导的EGFR信号传导抑制可能至少部分通过TNF-a/NF-kB调节的PHD3表达来介导，这有待进一步验证。
　　 在缺氧条件下，HIF-1a增强糖酵解，为胰腺癌细胞的生长和增殖提供必要的能量。数据表明，在含氧量正常的条件下，细胞增殖受到辐射治疗后降低，而增殖最显著时PHD3的过表达降低。在缺氧条件下，这两种作用都更加明显。因此，在低氧条件下，PHD3的过表达与放射结合会显着抑制Mia-paca2细胞的增殖。G2期的细胞对放射线治疗更为敏感，而S期的细胞则对放射线具有抵抗力。HIF-1a是缺氧条件下高表达和移位到G2期，从而影响在低氧条件下其效力放疗和凋亡抑制胰腺癌细胞。结果表明，PHD3的过表达与2Gy辐射联合可以显着提高缺氧条件下的细胞凋亡率。进一步的细胞周期分布分析表明，采用2Gy辐射处理的PHD3过表达显着增加了G2/M期细胞的百分比。这些结果表明，PHD3过表达与2Gy照射相结合能够逆转凋亡的逃逸并将胰腺癌细胞停滞在细胞周期的放射敏感期。PHD3过表达通过抑制EGFR/HIF-1a信号转导轴，增强了辐射诱导的Mia-paca2细胞增殖，凋亡和G2/M期细胞周期停滞的抑制作用。发现可能为PHD3过表达对放疗有辅助作用提供依据。然而，需要未来的研究来全面研究PHD3的调节机制，以便为胰腺癌放疗提供新的靶标。