胰腺癌是一种恶性程度高，预后差的消化系统肿瘤，占中国癌症死亡率的第六大主要原因。胰腺癌的发病率和死亡率呈现在世人面前的持续增长，总的5年生存率低于8％。其低5年生存率主要是由于早期转移到局部淋巴结和晚期血源性转移到远处的器官。缺乏早期可观察到的症状，在诊断时分期较高，几乎没有有效的疗法，这在很大程度上归因于胰腺癌的不良预后。最近，更多的研究集中在与胰腺癌预后相关的肿瘤生物标志物上。因此，当务之急是识别用于改善胰腺癌患者的预后新颖分子。生长分化因子11，也称为骨形态发生蛋白11，是TGF-B超家族和BMP亚家族中的一种分泌蛋白，可调节从前/后模式到肌发生的各种发育过程。它精密地调节肌肉生长，GDF8的负调节物。关于癌症，BMP充当因子即调节细胞增殖，凋亡，分化和也显示出与各种癌症如食管癌，相关联前列腺癌和乳腺癌。已在不同组织中测量GDF11。在大肠癌中发现了GDF11的异常表达，而高GDF11的表达与预后较差有关。最近的一项研究表明，GDF11在三阴性乳腺癌中显示出肿瘤抑制功能。然而，据胰腺癌治疗网所知，目前尚无关于GDF11在胰腺癌中的信息，而且GDF11在癌细胞中的生物学功能仍然未知。在这项研究中，首先检查GDF11在胰腺癌中的表达。通过体外研究，确定GDF11为胰腺癌生长和转移的新型抑制剂。胰腺癌治疗网还评估其与临床病理特征的关联，然后评估了其在胰腺癌患者中的预后价值。
　　 该研究是在医院批准后进行的，并征得每个患者的书面知情同意书。于2016年12月至2017年3月在医院从28例接受手术切除并经术后病理证实诊断为胰腺癌的患者中获得包括肿瘤组织和癌旁组织在内的组织样本。切除后立即将所有组织放入液氮中冷冻，并保存在-80°C下进行RT-PCR分析和Westernblot。胰腺癌细胞系AsPC-1，BxPC-3，CFPAC-1，PANC-1和SW1990以及人胰管上皮细胞系HPDE6-C7购自中国细胞系资源基础设施和在Dulbecco的改良Eagle's培养基中培养，并在5％CO2空气培养箱中于37°C补充10％FBS。使用TRIzol试剂从28位患者的新鲜肿瘤组织和癌旁组织中提取总RNA，并使用高容量cDNA逆转录试剂盒进行逆转录。使用ABI7500实时PCR系统通过qRT-PCR检测相应的肽基脯氨酰异构酶A和GDF11mRNA的水平。管家基因PPIA被用作GDF11mRNA的内标。
　　 使用五种胰腺癌细胞系，人胰管上皮细胞系，八种胰腺癌组织样本和成对的非肿瘤组织进行蛋白质印迹分析。使用带有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液从细胞和组织中提取蛋白质。然后，通过SDS-PAGE分离蛋白质并将其转移到聚偏二氟乙烯膜上。用在Tris缓冲盐水中的5％脱脂牛奶和0.01％Tween-20封闭膜，并与以1：200稀释的GDF11抗体一起孵育。TBS在4°C过夜。随后，在室温下孵育1：5,000稀释度的山羊抗小鼠IgG碱性磷酸酶连接的二抗。组织微阵列购自OutdoBiotechCo.Ltd。对组织微阵列的胰腺癌样品进行GDF11的IHC研究。兔抗人多克隆GDF11抗体以1∶500的稀释度使用。由三位经验丰富的病理学家使用12个标准点根据阳性细胞的百分比和染色密度对染色进行定量分析。为了进行数据分析，将染色得分<9定义为低表达，而得分9-12表示染色为高表达。为了进行细胞凋亡分析，将PBS中的1×106个细胞用FITC-AnnexinV和PI染色，并在室温下于黑暗中孵育。按照制造商的规程进行膜联蛋白V/PI染色测定，并使用流式细胞仪评估样品。数据采集和分析是在FC500MPL系统上进行的。通过将全长cDNA克隆到pLV-sfGFP-Puro载体中，构建了带有V5标签的GDF11，从而产生了慢病毒载体-GDF11。将没有cDNA片段的空载体用作阴性对照，称为LV-Control。按照制造商的说明，通过MTS分析在96孔板中测量细胞的生长。
　　 将不含FBS的培养基中的细胞接种到上层涂有Matrigel涂层或未涂覆的聚碳酸酯膜过滤器的上腔室中。下腔室充满了含10％FBS的培养基。然后，将细胞在37℃下孵育。24和48小时后，将通过膜迁移并附着在膜底部的细胞固定，并用0.05％的结晶紫染色30分钟。在显微镜下从五个随机场捕获图像。所有实验均重复三次。使用SPSS22.0软件进行统计分析。数据表示为平均值±标准偏差。学生的t检验用于比较两组之间的数据。皮尔逊卡方检验或Fisher精确检验用于分析GDF11表达与临床病理特征之间的关系。进行Kaplan–Meier分析以评估生存率的差异。每个测试都是双面的，P<0.05被认为具有统计学意义。
　　 为了验证GDF11的蛋白质和mRNA表达水平，本研究通过qRT-PCR检测了28对组织，包括胰腺癌样品和匹配的癌旁组织样品，并通过Westernblot检测8对蛋白。与正常组织相比，胰腺癌样品中GDF11的mRNA和蛋白水平降低。蛋白质印迹和qRT-PCR分析显示，胰腺癌细胞系中的GDF11表达比HPDE6-C7细胞系下调。此外，对28对胰腺腺癌组织和正常胰腺组织的IHC染色显示GDF11位于细胞质中。在邻近癌旁组织中有24/28检测到GDF11的高表达，而在癌组织中只有10/28检测到了GDF11。获得的结果表明，GDF11可能在胰腺癌中起抑癌作用。进一步总结63例胰腺癌组织芯片中GDF11表达与临床病理特征的相关性。与上述相同，IHC染色显示癌组织中GDF11的高表达率低于正常组织。Kaplan–Meier总体生存率方法表明，与低GDF11表达的患者相比，高GDF11表达的患者具有更好的生存率。单因素分析显示GDF11表达，分化，T分类和N分类是OS的重要预后因素。多变量分析进一步表明，高GDF11表达是预后良好的独立生物标志物。但年龄，性别和神经周浸润与OS无关。
　　 利用慢病毒转导系统来提高GDF11在PANC-1细胞系中的表达水平，并研究GDF11在胰腺癌细胞中的生物学功能。此外，对于相同的功能实验，使用siRNA技术在CFPAC-1细胞系中敲低GDF11的表达。通过qRT-PCR和Western印迹证实GDF11的过表达和敲低。增强的GDF11表达抑制了PANC-1细胞的细胞增殖，而转染GDF11–siRNA的CFPAC-1细胞则显示出肿瘤的生长。此外，迁移和侵袭试验显示，GDF11高表达组的细胞迁移和侵袭减少，而在GDF11下调的组中这些功能得到加速。这些结果表明，GDF11可能充当肿瘤抑制剂并抑制胰腺癌细胞的增殖，迁移和侵袭。为了进一步研究GDF11在胰腺癌中的作用，胰腺癌治疗网检查上述细胞系中GDF11过表达和敲低的凋亡率。具有增强的GDF11表达的PANC-1细胞系显示出明显更高的凋亡率。根据前一个结果，具有下调的GDF11表达的CFPAC-1细胞系显示出明显较低的凋亡率。
　　 胰腺癌是消化系统的复杂且异质性疾病，与各种基因缺失，突变和扩增有关。近年来，其发病率和死亡率显着上升。胰腺癌的5年生存率是恶性肿瘤最糟糕的预后之一，仅为5％。胰腺癌的危险因素包括吸烟，肥胖，2型糖尿病，饮酒和慢性胰腺炎。疾病的早期通常是无症状的，这表明很难早期诊断和治疗。一系列涉及特定途径和过程的基因的改变有助于胰腺癌的发生和发展。但是，目前尚无有效的生物标志物来预测这种癌症的临床行为。在当前的研究中，首先调查GDF11在组织和细胞系中的表达水平，然后评估GDF11蛋白表达与胰腺癌临床病理特征之间的关系。结果表明，胰腺癌组织中GDF11的表达明显低于正常胰腺组织。从GDF11在胰腺癌细胞系和人胰管上皮细胞系中的表达检查证明了相似的结果。在胰腺癌患者队列中，发现GDF11在肿瘤组织中的高表达与良好的预后相关。GDF11表达高的患者显示出明显更高的OS率。这些结果与人蛋白质图谱数据库中GDF11在胰腺癌中的预后总结一致。此外数据表明，高GDF11蛋白表达与轻度临床特征相关。这些发现表明，GDF11的高表达可能在胰腺癌的生长，侵袭和转移中起重要作用。
　　 因此，进一步探讨了GDF11在胰腺癌细胞中表达的功能机制。胰腺癌治疗网使用慢病毒转导系统增强了PANC-1细胞系中GDF11的表达，并使用RNAi处理降低CFPAC-1细胞系中GDF11的表达。功能研究表明，升高的GDF11表达促进了细胞凋亡，同时在PANC-1细胞中抑制了增殖，迁移和侵袭。相反，抑制凋亡，加速细胞增殖，迁移和侵袭与CFPAC-1细胞中GDF11的表达降低有关。发现GDF9通过保护肿瘤细胞免受caspase-3介导的凋亡而促进前列腺癌细胞的生长和增殖。功能实验的结果表明，GDF11通过促进细胞凋亡来抑制肿瘤的生长，从而具有抑制胰腺癌的作用。TGF-B超家族被认为是癌症的双重作用。TGF-B信号传导促进晚期癌症的进展，侵袭和转移，而在正常细胞和早期癌症中发现其抑制肿瘤的作用。一些报告揭示了GDF11表达在几种类型的肿瘤中的预后意义。发现大肠癌组织中GDF11mRNA的表达明显高于正常组织。GDF11表达高的患者有较高的淋巴结转移频率，且OS明显较差，这表明GDF11可能是结直肠癌患者的一种新型诊断和预后生物标志物。然而，最近的研究表明，GDF11在三阴性乳腺癌中发挥肿瘤抑制功能，并且其肿瘤抑制作用由于有缺陷的亚细胞加工而丧失。
　　 在肝癌中，GDF11的mRNA和蛋白表达下调，并通过Smad2/3信号通路发挥抑癌作用。本研究提示GDF11的异常表达与胰腺癌患者的预后显着相关。Kaplan–Meier方法显示，低GDF11表达的患者的OS率比高GDF11表达的患者差。总之，胰腺癌治疗网证明GDF11蛋白表达在胰腺癌组织中显着降低，并且与胰腺癌的肿瘤进展相关。GDF11的较高表达与胰腺癌患者的OS发生率更高显着相关。此外，GDF11的过度表达抑制了胰腺癌细胞的侵袭行为，可能是由于其对胰腺癌细胞的凋亡促进作用所致。因此，GDF11在评估胰腺癌患者的严重程度和预后方面可能是有价值的预测生物标志物。