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胰腺癌是全球第五大最常见的癌症

  胰腺癌是全球第五大最常见的癌症,也是癌症相关死亡的第二大主要原因。胰腺导管腺癌是最常见的胰腺癌亚型,约占所有胰腺癌病例的90%。尽管在过去的二十年中,人们一直致力于诊断和治疗方面的大量研究工作,但PDAC患者的临床结局仍然很差,其5年生存率不到7%。PDAC的不良预后主要与以下事实有关:即使在手术切除后,PDAC也容易发生局部浸润,转移和复发。近年来,在了解PDAC恶性行为的机制方面已取得了令人瞩目的发展,但是详细的发病机理仍是未知的,需要进一步研究。因此,迫切需要探索与PDAC起始和进展调控有关的机制,以鉴定出治疗这种致命疾病的有效方法。
   MicroRNA是一组内源性非编码短RNA分子,长度为18-22个核苷酸。通过以序列特异性方式直接结合其靶标mRNA的3'-非翻译区来负面调节基因表达。这种结合事件导致mRNA降解和抑制,从而降低蛋白质表达。充分证明miRNA异常表达并参与包括癌症在内的各种人类疾病的发病机制。几乎在所有人类癌症类型中都检测到miRNA的失调,并且可能起肿瘤抑制或致癌作用,这主要取决于其靶基因的特征。以前有报道称许多miRNA在PDAC中被下调或上调,它们的失调参与癌症相关的生物学行为的控制,包括细胞增殖,细胞周期分布,凋亡,转移以及对放疗和化疗的耐药性。因此,阐明失调的miRNA在PDAC中的详细作用和相关的作用机制对于诊断性生物标志物和治疗靶标的开发将特别有用。
   ETS1属于ETS转录因子家族,共有独特的DNA结合结构域。这是一种54kDa的核蛋白,与肿瘤发生和肿瘤发展有关。ETS1导致大量的肿瘤行为,包括肿瘤增殖,细胞周期,细胞凋亡,血管生成,迁移,侵袭和上皮间质转化。以前的研究表明,ETS1可以直接靶向人类癌症中的miRNA,并受到其负调控。例如miR-127通过直接靶向ETS1并抑制PI3K/AKT/mTOR途径来抑制前列腺癌的恶性表型。MiR-139-5p直接靶向ETS1,以限制有氧糖酵解,肝细胞癌的增殖,转移。然而尚未阐明PDAC中ETS1与miRNA之间的串扰。由于MiR-769-5p大量参与非小细胞肺癌和黑色素瘤的癌症生物学调控,因此引起我们的关注。尽管如此,miR-769在PDAC中的表达模式,生物学功能和作用机理尚未得到充分阐明。因此在研究中,我们旨在检测miR-769在PDAC组织和细胞系中的表达,并确定miR-769在PDAC进展中的潜在调控作用。此外,还探讨miR-769在PDAC细胞中的作用机制。miR-769参与PDAC的发现可能为PDAC的分子机制和治疗提供新颖的见解。从医院接受手术切除的53例PDAC患者中,收集PDAC组织和匹配的邻近的正常胰腺组织。在手术切除之前,没有患者接受过化学疗法或放射疗法的治疗。将所有组织样本在液氮中快速冷冻,然后保存在–80°C下。这项研究得到了伦理委员会的批准,并且根据赫尔辛基宣言进行。所有参与者均已就使用临床样品进行研究获得了书面知情同意书。
   正常人胰腺细胞系HPDE6c7购自典型培养物保藏中心。从中国科学院细胞库订购四种PDAC细胞系Sw1990,Bxpc-3,Panc-1和Aspc-1。所有细胞系均在补充了10%胎牛血清,100U/mL青霉素和100ug/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle's培养基中生长。将细胞常规地在37℃在含有5%CO2的气氛中培养。为了恢复miR-769的表达,将细胞以8×105个细胞/孔的密度接种到6孔板中,并用miR-769模拟物转染。miRNA模拟物阴性对照也购自基因制药有限公司,并用作miR-769模拟物的内部对照。用于干扰ETS1的小干扰RNA和si-NC由日宝生物技术有限公司提供。缺少3'-UTR的ETS1过表达质粒和空的pcDNA3.1载体是由中国科学院化学合成的。将质粒pcDNA3.1-ETS1引入细胞以上调内源性ETS1表达,并以空的pcDNA3.1载体作为内部对照。根据制造商的说明,使用Lipofectamine2000进行所有转染程序。
   按照制造商的规程,使用TRIzol试剂从组织或细胞中分离总RNA。为了分析miR-769表达,使用TaqManMicroRNA逆转录试剂盒对总RNA进行cDNA合成。之后用TaqManMicroRNAPCRKit进行qPCR。为了测量ETS1mRNA的表达,使用M-MLV逆转录酶通过反转录从总RNA中化学合成cDNA。之后,使用SYBR-GreenMasterMix评估ETS1mRNA的表达水平。小核RNAU6和GAPDH分别用作miR-769和ETS1mRNA标准化的对照。转染24小时后,将每孔3000个细胞播种到96孔培养板中,并在37%的空气中,在5%CO2的气氛中保持不同的时间:接种后0、24、48和72h。用CCK-8测定法评价细胞增殖。简而言之,将10uLCCK-8溶液添加到每个孔中,然后在37°C下孵育2小时。在分光光度计上在450nm波长下检测每个孔的光密度。使用膜联蛋白V-异硫氰酸荧光素细胞凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡的检测。孵育48小时后,收集转染的细胞,用冰冷的磷酸盐缓冲液冲洗三次,然后重悬于100uL结合缓冲液中。接下来将细胞悬液用试剂盒随附的5uL膜联蛋白V-FITC和5uL碘化丙啶溶液染色。在室温下于黑暗中孵育20分钟后,通过流式细胞仪测定凋亡细胞的百分比。
   对于入侵检测,105将200uL无FBSDMEM中的转染细胞接种到预先涂有Matrigel的Transwell室的顶部隔室中。下部隔室用500uL含20%FBS的DMEM覆盖,用作化学吸引剂。培养24小时后,用棉签轻轻除去保留在Transwell室上侧的非侵袭性细胞。用100%甲醇固定侵袭细胞,用0.1%结晶紫染色并定量。在倒置光学显微镜下对随机选择的五个视野中的侵袭细胞进行计数。Transwell迁移分析的方法与入侵分析的方法相同,不同之处在于,未在腔室中预先涂有Matrigel。所有动物实验的程序均已获得第一医院机构动物护理和使用委员会的批准,并遵循《中华人民共和国动物保护法》进行。雌性BALB/c裸鼠购自军医大学动物中心。将miR-769模拟物转染或miR-NC转染的Sw1990细胞皮下注射到裸鼠的后腹。接种后2周,使用游标卡尺测量肿瘤异种移植物的宽度和长度。通过以下公式计算肿瘤体积:体积=0.5×宽度2×长度。每两天进行一次肿瘤体积的测量,直到注射后4周。将所有裸鼠安乐死以切除肿瘤异种移植物,并测量肿瘤重量。
   在室温下将肿瘤异种移植物在4%中性福尔马林中固定24小时,然后将其包埋在石蜡中。将石蜡切成4um的切片后,将它们在二甲苯中脱蜡,在分级的醇系列中再水化,并用沸腾的柠檬酸盐缓冲液进行探测。为了减少非特异性结合,将切片用5%牛血清白蛋白在37°C下探测45分钟。与Ki-67抗体在4°C孵育16h后,将切片与辣根过氧化物酶偶联的二抗在室温下进一步孵育1h。之后,将切片在室温下用1%苏木精复染5分钟,然后在一系列梯度的乙醇中脱水。最后,利用包括TargetScan,miRDB和miRanda在内的生物信息学工具来搜索miR-769的潜在靶基因。转染后48小时测量荧光素酶活性按照制造商的方案使用双荧光素酶报告基因检测系统。萤火虫荧光素酶的活性被标准化为海肾荧光素酶的活性。
   用RIPA裂解缓冲液从培养的细胞中提取总蛋白。用BCA蛋白分析试剂盒测量总蛋白浓度。在10%的凝胶中通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离等量的总蛋白,然后将其转移至聚偏二氟乙烯膜上,然后在室温下于5%的无脂肪牛奶中封闭2h,该牛奶在Tris缓冲盐水中稀释,稀释度为0.1补间20的百分比。在TBST中与在4°C孵育过夜后,将膜用TBST洗涤三次,然后与辣根过氧化物酶偶联的山羊抗小鼠IgG二抗,在室温下放置2小时。蛋白质信号的检测是通过增强型化学发光检测系统进行的。该研究中使用的主要抗体包括小鼠抗人ETS1单克隆抗体和小鼠抗人GAPDH抗体。GAPDH用作加载控件。所有数据均以平均值±标准偏差表示。在SPSS软件16.0版中进行统计分析。两组之间的差异通过Student'st检验或单因素方差分析,然后进行Student-Newman-Keuls事后检验进行评估。生存分析通过Kaplan-Meier方法和logrank检验进行。卡方检验用于分析PDAC患者中miR-769表达与临床参数之间的可能相关性。通过Spearman相关分析评估了miR-769与ETS1mRNA水平之间的关联。P<0.05的数据被认为具有统计学意义。
   为了揭示miR-769在PDAC中的表达模式,首先通过RT-qPCR分析53对PDAC组织样品和匹配的正常胰腺组织样品中miR-769的表达。在PDAC组织样品中,miR-769的表达低于在邻近的正常胰腺组织中的表达。此外,在四种PDAC细胞系和正常人胰腺细胞系HPDE6c7中测量了miR-769表达。在RT-qPCR分析中获得的结果表明,与HPDE6c7细胞相比,在所有四个测试的PDAC细胞系中miR-769均被下调。然后确定降低的miR-769表达在PDAC患者中的临床价值。根据PDAC组织样本中miR-769表达的中位数,将所有患者分为两种亚型:低miR-769表达组和高miR-769表达组。miR-769表达与临床参数之间的相关性分析表明,降低的miR-769表达与TNM分期和淋巴结转移显着相关。此外,Kaplan–Meier生存分析表明,携带低miR-769表达的PDAC患者的总生存期明显短于那些高miR-769表达的患者。这些结果表明,降低的miR-769水平可能与PDAC的进展密切相关。
   在Sw1990和Panc-1细胞系中,miR-769的表达相对低于在Bxpc-3和Aspc-1细胞系中的表达。因此,选择两种细胞系用于进一步的实验。为了研究miR-769在PDAC中的潜在生物学作用,用miR-769模拟物或miR-NC转染了Sw1990和Panc-1细胞系。结果在用miR-769模拟物转染后,miR-769在Sw1990和Panc-1细胞中有效过表达。进行CCK-8分析和流式细胞仪以确定miR-769上调在体外PDAC细胞增殖和凋亡中的作用。观察到,用miR-769模拟物转染的Sw1990和Panc-1细胞显示出增殖减少和凋亡增加。与用miR-NC转染的细胞相比。接下来,为了评估miR-769对PDAC细胞转移的影响,在miR-769模拟或miR-NC转染后,对Sw1990和Panc-1细胞进行Transwell迁移和侵袭试验。结果显示,外源性miR-769表达显着降低了Sw1990和Panc-1细胞的迁移能力和侵袭能力。总之,这些结果暗示miR-769可通过在体外抑制细胞生长和转移而在PDAC的进展中起肿瘤抑制作用。
   为了阐明miR-769减弱PDAC细胞侵袭性的分子机制,进行生物信息学分析以预测miR-769的潜在靶标。ETS1的3'-UTR包含一个miR-769的假定结合位点,并被选中进行验证,因为该基因先前已牵涉到PDAC的恶性进展。测试miR-769是否可以直接结合ETS1的3'-UTR对于mRNA,荧光素酶报告基因分析是在Sw1990和Panc-1细胞上进行的,这些细胞与miR-769模拟物或miR-NC以及pmirGLO-ETS1-3B-UTRwt或pmirGLO-ETS1-3B-UTRmut共转染。结果表明与miR-NC组相比,miR-769的上调明显降低ETS13'-UTR中带有野生型miR-769-结合位点的质粒的荧光素酶活性。相比之下,在Sw1990细胞和Panc-1细胞中,用含有突变体miR-769-结合位点的报道质粒转染的抑制作用被废除了。接下来,评估miR-769对PDAC细胞中内源ETS1表达的调节作用。如预测的那样,强制的miR-769表达降低了两种mRNA的ETS1表达和蛋白水平在Sw1990和Panc-1细胞中。总体而言,这些结果意味着ETS1是PDAC细胞中miR-769的直接靶基因。
   ETS1被证实是PDAC细胞中miR-769的直接靶基因;因此尝试进一步评估PDAC组织中miR-769与ETS1之间的关系。首先,进行RT-qPCR以确定53对PDAC组织样品和匹配的邻近正常胰腺组织中ETS1mRNA的水平。在PDAC组织样品中ETS1mRNA的表达明显高于正常胰腺组织样品中的ETS1mRNA的表达。此外,在PDAC组织样品中,miR-769与ETS1mRNA水平之间存在负相关关系。此外,mRNA和ETS1蛋白水平在高miR-769表达组明显低于低miR-769表达组。这些结果表明,PDAC组织样品中ETS1的上调至少部分是由miR-769表达不足引起的。在确定ETS1为miR-769的直接靶标之后,接下来详细说明ETS1与PDAC的恶性表型有关。通过将si-ETS1导入Sw1990和Panc-1细胞进行功能丧失测定。si-ETS1的转染有效地敲低Sw1990和Panc-1细胞中ETS1的表达,如Western印迹法所证实。然后,功能实验表明,Sw1990和Panc-1细胞中的ETS1敲低在体外降低它们的增殖并促进它们的凋亡。此外,迁移和侵袭性ETS1敲低后,Sw1990和Panc-1细胞明显受损。因此,这些观察结果证实,ETS1的下调介导PDAC细胞中miR-769的作用。
   进行一系列抢救实验,以验证miR-769在PDAC细胞中的抑癌活性是否由ETS1的抑制介导。Sw1990和Panc-1细胞与miR-769模拟物和ETS1过表达质粒pcDNA3.1-ETS1或空载体pcDNA3.1共转染。分析证明,与miR-769模拟物和空pcDNA3.1共转染的细胞相比,在与miR-769模拟物和pcDNA3.1-ETS1共转染的Sw1990和Panc-1细胞中恢复的ETS1蛋白水平。在功能分析中,重新引入ETS1表达可部分逆转miR-769对Sw1990和Panc-1细胞增殖的影响,细胞凋亡,迁移和入侵。因此这些结果清楚地表明,miR-769对PDAC细胞生长和转移的抑制作用至少部分是由直接抑制ETS1表达介导的。为了检查miR-769对体内肿瘤生长的影响,将转染miR-769模拟物或miR-NC的Sw1990细胞皮下接种到裸鼠的侧面,建立异种移植模型。与miR-NC组相比,注射miR-769过表达的Sw1990细胞的裸鼠的肿瘤异种移植明显更小。此外,miR-769模拟组的肿瘤重量显着低于miR-NC组。成功过表达,ETS1mRNA下调和蛋白质水平在来自miR-769模拟组的肿瘤异种移植物中得到验证。然后,免疫组织化学,与miR-NC组相比,过表达miR-769的肿瘤异种移植物显示出较低的Ki-67表达。所有这些结果表明,miR-769的过表达通过减少ETS1的表达而降低体内PDAC的生长。
   据报道,许多miRNA在PDAC中被失调,而miRNA的失调与PDAC的癌变和发展有关。因此,更好地了解PDAC中的miRNA可能会增进对PDAC发病机理的了解,并有助于确定这种侵袭性疾病中有价值的治疗靶标。然而,具体的miRNA在PDAC中的详细作用仍未明确。在这里,首次尝试测量miR-769在PDAC中的表达,并确定miR-769在PDAC进程中的生物学功能。此外,探索miR-769在PDAC细胞中的作用机制。在非小细胞肺癌中,MiR-769被下调,这种下调与临床分期和淋巴结转移密切相关。携带低miR-769水平的非小细胞肺癌患者的临床预后要比高miR-769水平的患者差。相反,黑色素瘤中的miR-769被上调。这些矛盾的发现表明,人类miR-769表达模式是癌症特异性的。但miR-769在PDAC中的表达状态尚不清楚。在研究中通过RT-qPCR测量其在PDAC组织样品和细胞系中的表达。结果表明,miR-769在PDAC中被下调,其下调与TNM分期和淋巴结转移有关。此外,具有低miR-769表达的PDAC患者的总生存期明显短于高miR-769表达的患者。因此,miR-769可能是PDAC的有吸引力的诊断和预后生物标志物。
   MiR-769在非小细胞肺癌中具有抑癌活性。MiR-769直接靶向TGFBR1mRNA,以在体外和体内抑制非小细胞肺癌细胞的生长和转移。相反,在黑素瘤中miR-769被鉴定为致癌性miRNA。通过直接靶向GSK3BmRNA,miR-769的上调在体外促进黑素瘤细胞生长和集落形成。但miR-769是否参与PDAC进程的调节仍很难确定。miR-769表达的恢复可通过抑制体外细胞生长和转移以及体内肿瘤生长来充当PDAC中的肿瘤抑制因子。这些发现表明,miR-769可能被验证为针对PDAC的抗癌疗法的潜在靶标。鉴定PDAC中miR-769的直接靶基因对于理解miR-769在PDAC的发病机理和进展中的参与很重要。因此进行一系列实验以研究PDAC细胞中miR-769的直接靶基因。ETS1是ETS转录因子家族的成员,已被证实是PDAC细胞中miR-769的直接靶标。ETS1与包含GGAA/T核心基序的特定DNA序列直接相互作用,并参与癌症的形成和发展。它在各种类型的人类癌症中上调,例如结肠直肠癌,乳腺癌,胃癌和喉鳞状细胞癌。此外,ETS1在PDAC中过表达,而ETS1的上调与肿瘤的分化状态有关。ETS1通过调节细胞增殖,转移,上皮间质转化,耐药性和血管生成,在PDAC细胞恶性进展中起关键作用。在我们目前的研究中,证明miR-769直接靶向ETS1mRNA在体外和体内抑制PDAC细胞的恶性肿瘤。
   因此,miR-769介导的对ETS1的抑制可能是针对PDAC的潜在治疗策略,将在以后进行验证。在这项研究中,我们没有研究miR-769过表达对体内PDAC细胞转移的影响。进一步研究中将miR-769模拟物和miR-NC转染的PDAC细胞注射到裸鼠的尾静脉中,并用于确定PDAC细胞在转移部位扩散和生长的能力。研究表明miR-769至少部分通过直接靶向ETS1mRNA来在PDAC中发挥肿瘤抑制作用。这些结果为miR-769在PDAC治疗中的应用提供了理论基础。

 
  索托拉西布  
  索托拉西布是一种KRAS G12C抑制剂,2021年5月获得美国FDA批准,用于治疗先前已接受过至少一种系统疗法、经FDA批准的检测方法证实存在KRAS G12C突变、局部晚期或转移性非小细胞肺癌与胰腺癌患者。成为首个用于KRAS G12C突变的局部晚期或转移性NSCLC患者的靶向疗法。  2021年11月索托拉西布在欧盟获批上市。
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