胰腺癌是消化道的恶性肿瘤，其中约90％来自导管上皮的PDAC。PDAC是美国癌症相关死亡的第三大主要原因，据估计到2030年，PDAC将成为该国仅次于肺癌的第二大癌症相关死亡的原因。监测，流行病学和最终结果数据集表明，晚期PDAC患者的五年生存率仅为8.5％。目前，化学疗法和放射疗法是PDAC的主要治疗方法，尽管它们的预后较差，而患者的5年生存率并未显着提高。因此，需要紧急发现新颖且有效的PDAC治疗方法以改善预后和患者生存。先前的研究表明，某些细胞在多种恶性肿瘤中均表现出干细胞样特征，因此是癌症干细胞。2006年美国癌症研究协会将CSC定义为肿瘤中可以自我更新并引起构成肿瘤的异种癌细胞系的细胞。然而研究表明，CSC对化学疗法和放射疗法有抵抗力，因此被认为是肿瘤复发的主要原因。
　　 探索基于CSCs的PDAC治疗对控制肿瘤具有重要意义。已经显示出在基因组中具有编码结构域的非编码RNA转录本，但大多数未翻译成蛋白质，在各种细胞的生理功能中起着关键作用。具体而言，长的非编码RNA在染色质动力学，基因表达，细胞生长和分化中起着重要的调节作用。先前的研究表明，同源异型盒转录反义RNA已被广泛证实在包括PDAC在内的多种肿瘤中起着癌促进因子的作用，并且对各种肿瘤中的CSC具有重要的调节作用。HOTAIR可以促进乳腺癌CSC的增殖，克隆形成，侵袭和自我更新。其他研究工作表明，针对LncRNA的miRNA调控是肿瘤发展的主要方式之一，发现miR-34a可以调控多种肿瘤中类似CSCs的特性。然而，迄今为止，关于HOTAIR是否通过靶向miR-34a来调节PDACCSC样特性尚无知。此外，广泛的局部肿瘤浸润和早期全身扩散是PDAC的主要特征之一。在本研究中，探讨HOTAIR对CSC样特性，PDAC侵袭和迁移的影响，目的在于提供洞察力，以指导PDAC新型疗法的开发。
　　 人正常导管上皮细胞和PDAC细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所细胞库。将细胞在补充了10％FBS，100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素的RPMI-1640培养基中培养，并在保持5％CO2和湿度的潮湿箱中孵育。温度为37°C。靶向HOTAIR，对照siRNA，pcDNA3.1-HOTAIR和对照pcDNA3.1的小干扰RNA购自Ribobio。miR-34aagomiR，miR-34aantagomiR和miRNAago/antago对照由上海基因制药有限公司设计和合成。根据制造商的说明，使用Lipofectamine2000进行转染。根据说明，使用Trizol试剂从细胞中提取总RNA。使用SuperScriptIII逆转录酶试剂盒合成互补DNA，然后使用UltraSYBR混合物试剂盒进行qRT-PCR。在以下条件下，在ABIStepOne循环仪中进行qRT-PCR反应；最初在95°C变性1分钟，在95°C变性15分钟，在60°C退火2分钟，并在72°C延伸30秒。分析了生长曲线的对数线性阶段的结果，并使用2-ΔΔCT方法进行了相对定量。
　　 为了提取蛋白质，首先将CFPAC-1和SW-1990细胞用RAPI蛋白质裂解缓冲液裂解30分钟，刮下并转移到预冷的1.5mLEP管中，然后离心。使用BCA试剂盒对上清液进行定量，然后在10％SDS-PAGE凝胶上分离。将内容物在室温下用5％脱脂奶粉封闭2小时，转移到PVDF膜上。和Oct4在4°C下。第二天TBST洗涤3次，每次5分钟，然后与山羊抗兔IgGH＆L一起孵育，并在室温下封闭1小时。最后是ECL化学发光解决方案，然后在成像系统上进行可视化。使用Image软件分析获得的图像中的蛋白条带。使用细胞计数试剂盒8进行CFPAC-1和SW-1990细胞增殖测定。根据制造商的协议，将细胞接种在96孔板中，每个孔的总体积设置为100uL，每组三个重复孔。将细胞转染24小时，向每个孔中加入10uLCCK-8溶液，然后将板置于保持在37℃，5％CO2的加湿培养箱中。培养0、24、48、72、96小时后记录光密度值，然后在酶标仪上于450nm波长处测量吸光度。
　　 CFPAC-1和SW-1990细胞在无血清培养基中培养，该培养基含有DMEM/Ham营养混合物F-12和20ng/mL表皮生长因子，10ng/mL人成纤维细胞基本生长因子和2％B-27持续14-21天。之后，使用直径大于40um的TE2000-U倒置显微镜对细胞球进行计数，并捕获图像。制备基质胶和无血清的RPMI-1640培养基，比例为1：3，并将其铺展在Transwell的上部腔室中。将对数期的CFPAC-1和SW-1990细胞用胰蛋白酶消化，并接种到Transwell室的24孔板中。此后，将100uL细胞悬液添加到上腔室中，将250uL包含10％胎牛血清的RPMI-1640添加到下腔室中，并将CFPAC-1和SW-1990细胞在70°C下孵育48小时37°C和5％CO2。用结晶紫染色15分钟后，将室的微孔膜下的那些用4％多聚甲醛固定15分钟。用PBS冲洗室，干燥并置于倒置显微镜上观察。弃去原始细胞培养基，然后添加35uL/每孔新鲜培养基的孔。之后，我们向每个孔中添加35uL/孔的萤光素酶底物，然后使用酶标仪测量吸光度。最后添加30uLStop试剂，并使用酶标仪测量细胞的吸光度。
　　 使用含有t7的引物，通过PCR扩增包含全长TUG1或阴性对照序列的DNA片段。将得到的片段克隆到已经通过XhoI消化线性化的质粒载体GV394中。使用T7RNA聚合酶和生物素RNA标记混合物进行生物素标记的RNA的逆转录。使用RNeasyMini试剂盒提取RNA，并用无RNase的DNaseI处理，然后如上所述进行qRT-PCR。昆明医科大学动物实验伦理审查委员会批准了所有涉及小鼠的研究。严格遵守中国卫生研究院《实验动物的护理和使用指南》进行实验。从中国广东省医学检验动物中心购买6-8周大的BALB/c雌性裸鼠。将小鼠维持在一个小房间中，以12小时的明/暗周期，22±2°C的温度和55±5％的相对湿度喂养。将所有小鼠分为si-NC和si-HOTAIR组，每组6只，然后将si-HOTAIR转染的CFPAC-1细胞及其相应的阴性对照皮下注射。使用游标卡尺每3天监测一次新兴肿瘤，并计算肿瘤体积。体重也用于监测动物的健康。32天后，用1％75mg/kg的戊巴比妥钠麻醉小鼠，并通过颈脱位法处死。然后称重并记录每只小鼠的肿瘤。使用SPSS20.0软件对所有数据进行统计分析。两组之间的比较使用t检验进行，而多组之间的比较则通过单因素方差分析进行。使用GraphPadPrism7软件生成图形。P<0.05或P<0.001被认为具有统计学意义。
　　 HOTAIR在HPDE6-C7，SU.86.86，CFPPAC-1，SW-1990和PL45细胞中的差异表达分析表明，相对于HPDE6-C7细胞，PDAC中的HOTAIR显着上调。在这些PDAC细胞中，分别在CFPAC和SW-1990细胞中观察到最高和最低的HOTAIR表达。因此，在SFM中培养CFPAC和SW-1990细胞，然后进行球形成分析以富集CSC。还进行蛋白质印迹和qRT-PCR分析，以检测CSCs标记的SOX2，Nanog和Oct4的表达水平。结果表明，与在SSM中培养的CFPAC或SW-1990细胞相比，SPAC中培养的CFPAC或SW-1990细胞中SOX2，Nanog和Oct4蛋白和mRNA的显着上调。还观察到相对于SSM-CFPAC-1或SSM-SW-1990组，SFM-CFPAC-1或SFM-SW-1990组中的HOTAIR显着上调在miR-34a中观察到。此外，CFPAC中的球体数量和增殖显着高于SW-1990细胞。总体而言，这些发现表明HOTAIR在PDAC的CSC中过表达，而miR-34a则呈现相反的模式。因此，HOTAIR和miR-34a可能调节类CSCs的特性。
　　 为了了解异常HOTAIR表达对PDAC的CSCs样特性的影响，将si-HOTAIR或pcDNA3.1-HOTAIR转染到CFPAC-1或SW-1990细胞中，然后分析CSCs样特性的变化。qRT-PCR结果显示，si-HOTAIR或pcDNA3.1-HOTAIR转染后，HOTAIR显着下调或上调，而miR-34a观察到相反的模式。对HOTAIR对CSCs标记表达的影响的分析表明，该LncRNA显着促进了CFPAC-1以及SW-1990细胞中SOX2，Nanog和Oct4蛋白和mRNA的水平。对CFPAC-1和SW-1990细胞的增殖和球化能力的分析表明，敲除HOTAIR会抑制PDAC细胞的增殖和球体数量，而其过表达则产生相反的模式.还研究HOTAIR对侵袭和迁移的影响，因为广泛的局部肿瘤浸润和早期全身扩散代表PDAC的主要特征。Transwell分析的结果表明，si-HOTAIR中CFPAC-1细胞的侵袭和迁移速率明显高于si-NC组。但是，pcDNA3.1-HOTAIR组中SW-1990细胞的侵袭和迁移速率显着高于pcDNA3.1-NC组。总的来说，这些结果表明，HOTAIR通过促进类CSCs特性，CFPAC-1细胞的侵袭和迁移来调节PDAC的发育。
　　 考虑到miR-34a在SFM-CFPAC-1和SFM-SW-1990细胞中的异常低表达，假设HOTAIR可以调节miR-34a的表达。因此，我们探讨了miR-34a对CSC样特性，PDAC细胞侵袭和迁移的影响。qRT-PCR结果表明，相对于以前的NC或antago-NC，miR-34a明显上调或下调，而HOTAIR相反。值得注意的是，HOTAIR和miR-34a似乎相互作用。Westernblot和qRT-PCR表明，相对于ago-NC，ago-miR-34a组的SOX2，Nanog和Oct4水平显着降低，而antago-miR-34a组的SOX2，Nanog和Oct4水平显着高于antago-NC的那些。此外，CCK-8和球形成分析的结果表明，过度表达的miR-34a促进CFPAC-1细胞的增殖和球体数量，而将其敲低则引起相反的反应。分析miR-34a对PDAC细胞的侵袭和迁移的作用表明，过表达该miRNA会显着抑制这两个过程，而将其敲低会促进侵袭和迁移。这些结果表明，miR-34a可能通过与HOTAIR相互作用抑制了CSCs样特性，PDAC细胞的侵袭和迁移。
　　 由于大量研究表明，LncRNA直接靶向miRNA来调节miRNA的表达。我们假设HOTAIR可能与miR-34a相互作用。因此，我们针对Starbase生物信息数据库进行预测分析，发现HOTAIR和miR-34a具有靶向结合序列。通过双荧光素酶报告基因检测验证HOTAIR和miR-34a之间的靶向关系，结果表明miR-34a可以显着抑制野生型的荧光素酶活性，但对突变型HOTAIR的活性无明显影响。随后，使用RNA下拉测定法进一步探讨HOTAIR是否直接与miR-34a相互作用。qRT-PCR结果显示，被HOTAIR下拉的沉淀物含有大量的miR-34a。先前的研究还表明，miRNA通过RNA诱导的沉默复合物发挥其基因沉默作用，而Ago2是RISC的核心成分。基于此，进行Ago2-RIP分析，以验证HOTAIR和miR-34a是否是同一RISC的组成部分。综上所述，对从复合沉淀物中提取的RNA的qRT-PCR分析显示，AGO2中的HOTAIR和miR-34a水平明显高于IgG组。此外，敲低miR-34a会显着上调HOTAIR。这些结果表明，miR-34a是HOTAIR的直接靶标，并且HOTAIR可以负调控miR-34a的表达。
　　 许多研究证明JAC2/STAT3途径在CSC中的调节作用。基于此，探讨HOTAIR通过miR-34a对JAK2/STAT3途径的作用。蛋白质印迹表明，HOTAIR显着上调了PDAC细胞中STAT3和JAK2的磷酸化，而miR-34a抑制了HOTAIR对JAK2/STAT3途径的作用。通过miR-34a/JAK2/STAT3途径分析HOTAIR对PDAC细胞中CSCs特性的影响，发现miR-34a阻断了该LncRNA对这组细胞中SOX2，Nanog和Oct4表达的影响。CCK-8和Sphere形成分析的结果表明，敲低或过表达HOTAIR会显着抑制或促进PDAC细胞的增殖和球化能力，而HOTAIR和miR-34a的共敲减或共过表达恢复了这些表型。使用Transwell测定法通过miR-34a/JAK2/STAT3途径进一步分析HOTAIR对HOTAIR对CFPAC-1细胞侵袭和迁移的影响，发现显着下调相对于si-NC或pcDNA-3.1-NC组中si-HOTAIR或pcDNA-3.1-HOTAIR中PDAC细胞的侵袭和迁移数量。HOTAIR和miR-34a的共同敲除或共同过表达导致si-NC或pcDNA-3.1-NC在CFPAC-1细胞中的侵袭和迁移数量没有显着差异。总体而言，这些结果表明，HOTAIR通过抑制miR-34a表达来激活JAK2/STAT3途径，从而促进CSCs特性，PDAC细胞的侵袭和迁移。
　　 我们建立一个稳定敲除HOTAIR的CFPAC-1细胞模型，并将这些细胞皮下注射到裸鼠中，以研究HOTAIR在体内的致瘤性。qRT-PCR结果显示，si-HOTAIR肿瘤组织中的HOTAIR水平显着低于si-NC组。注射后32天，对小鼠中的肿瘤进行分析，发现si-HOTAIR中的质量和体积显着高于si-NC组。但是，我们观察到裸鼠的肿瘤质量无明显差异。此外，相对于si-NC组，si-HOTAIR中的miR-34a显着上调，而SOX2，Nanog，Oct4，p-STAT3和p-JAK2均被下调。此外，IHC结果表明，敲除HOTAIR会显着抑制Ki-67表达。这些结果表明敲低HOTAIR显着抑制CFPAC-1细胞的致瘤性。
　　 PDAC是最常见的PC类型之一，是一种以高死亡率和非常差的预后为特征的恶性肿瘤。根据美国癌症协会的统计，每年影响PDAC患者的人数以及相关的死亡人数为44,330人。以前的研究表明，CSCs是自我更新的肿瘤细胞，可以在大多数类型的恶性肿瘤中鉴定出来，并且有助于治疗后的肿瘤发作，发展，耐药性，复发和转移。根据这些报告，靶向CSCs治疗可能是肿瘤治疗的突破。在本研究中，通过SFM分离PDAC中的CSC，发现富含SFM的CSC具有更丰富的CSCs标记SOX2，Nanog和Oct4。此外，我们观察到富含SFM的CSC中HOTAIR异常上调，而miR-34a相反。基于这些结果，随后评估了HOTAIR和miR-34a对CSC样特性，CFPAC-1细胞的侵袭和迁移的影响，然后使用体内实验验证这一发现。
　　 许多研究已将LncRNA与多种癌症相关联，包括前列腺癌，乳腺癌，胃癌，肺癌和肝癌。已经证实，高表达的HOTAIR是乳腺癌转移和不良预后的重要预测因子。此外，HOTAIR在人非小细胞肺癌中被上调，在人非小细胞肺癌中，HOTAIR会诱导NSCLC细胞在体外迁移和生长。除此之外，HOTAIR与肝细胞癌的进展和预后相关。在这项研究中，我们发现敲除HOTAIR可以抑制CSCs样特性，CFPAC-1细胞的侵袭和迁移，这与先前的报道一致，即HOTAIR对头颈部鳞状细胞癌小鼠的肿瘤生长具有抑制作用异种移植肿瘤模型。该研究还评估HOTAIR在体内肿瘤发展中的作用。降低HOTAIR可以减少肿瘤的数量和体积，并且可以下调肿瘤组织中的SOX2，Nanog，Oct4和Ki-67，从而证实其在体内抑制肿瘤生长的作用。结果还表明，HOTAIR靶向miR-34a，并对其表达水平产生负调控。
　　 除了在多种癌症中起抑癌作用外，miR-34a还被证明在癌症的发生，发展和治疗中起着重要的调节作用。先前的研究表明，与正常PDAC细胞相比，miR-34a在PDAC细胞中的表达显着降低。此外，miR-34a在癌症中与HOTAIR密切相关。例如，最近的一项研究证明HOTAIR对miR-34a启动子具有物理作用。在富含乳腺癌细胞的CSC的亚群中，HOTAIR靶向miR-34a来抑制miR-34a，从而导致Sox2的上调。此外，人们认为miRNA在CSC的调节中起着重要的作用。在这项研究中，过度表达的miR-34a抑制了CSCs样特性，CFPAC-1细胞的侵袭和迁移，表明它可能在PDAC中起着抑癌作用。JAK/STAT途径在体内许多信号转导中起着至关重要的作用。特别是，JAK的激活在细胞分化，增殖，凋亡和迁移中起重要作用，而其结构激活则促进STAT家族的磷酸化。STAT3是STAT家族的一员，近年来已进行广泛的研究。例如，发现JAK2/STAT3途径的异常激活可促进多种癌症的CSC样特性，例如结直肠癌，肝癌，乳腺癌和肺。此外miRNA-34a可通过JAK2/STAT3途径抑制子宫平滑肌肉瘤的发展。
　　 另一方面，专家发现HOTAIR通过激活JAK2/STAT3途径促进多发性骨髓瘤细胞的增殖并抑制其凋亡。在我们的研究之前，尚不清楚HOTAIR是否可以通过与miR-34aPDAC相互作用来调节JAK2/STAT3途径。然而结果表明，HOTAIR抑制miR-34a激活JAK2/STAT3途径，从而促进CSCs样特性，CFPAC-1细胞的侵袭和迁移。但是，miR-34a调控JAK2/STAT3途径的机制仍然未知。总之，我们揭示HOTAIR通过其调节CSC样特性，PDAC细胞的侵袭和迁移的潜在分子机制。值得注意的是，HOTAIR靶向miR-34a以激活JAK2/STAT3途径，以促进CSC样特性，CFPAC-1细胞的侵袭和迁移。体内实验表明，击倒HOTAIR会抑制体内肿瘤的生长。