胰腺癌
 
胰腺癌
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胰腺癌信息  

差分化胰腺癌关键途径和潜在关键基因

  胰腺腺癌占人类胰腺癌的95%以上,是一种高度侵袭性的肿瘤,其死亡率实际上与发病率相当。世界上PDAC患者的五年生存率不超过5%。到2030年PDAC预计将成为肿瘤相关死亡的第二大主要原因。不到20%的患者可以完全切除,而且即使在可能的根治性切除后,大多数患者仍将获得早期进展,五年生存率低于25%。尽管近年来在胰腺癌的手术和辅助化学疗法方面取得进展,但其存活率并未得到明显提高。因此,迫切需要探索有效的指标以改善PDAC的预后。基因表达异常是人类疾病的共同主题,相应的mRNA在肿瘤相关疾病的发生和发展中起着关键作用。高通量测序技术的出现使研究人员能够检测到大多数肿瘤的突变和转录情况的完整数据。迄今为止,许多研究人员已经对PDAC样品进行了全面的下一代测序分析,旨在确定其突变与肿瘤形成有关的新型生物标志物。
   RNA-seq被认为是过滤PDAC进程中枢基因标记的有前途的工具。对RNA-seq数据和转录组的生物信息学分析发现,PDAC中存在一组改变的基因,这极大地促进对肿瘤发生的生物学过程以及人类组织样品的治疗方法的了解。已证明SMAD3在诱导上皮-间质转化中发挥了积极作用,并被认为是表明预后不良的有效生物标志物。一些研究表明,富含磷酸肌醇3-激酶-Akt途径的THBS1可以促进PDAC的发展和进程。有学者人认为KRAS,TP53,DPC4和SMAD4作为可能在PDAC中导致肿瘤复发和抗肿瘤免疫力的肿瘤驱动基因,同时,可以开发针对这些途径的靶向药物。然而,尽管在基因水平上对PDAC的肿瘤起始和进展的理解方面取得巨大进展,但尚无被广泛认可的具有高敏感性和特异性的预后生物标志物,其可以准确地预测预后并可以用于术后个体化治疗。目前,RNA-seq技术与生物信息学分析相结合使其成为在PDAC的形成和发展过程中全面探索mRNA表达异常的一种有前途的方法。对这些基因的研究可以提供有价值的信息,这些信息可以帮助设计出针对患者的最佳治疗方法,甚至可以预测疾病的复发。
   在本研究中,通过整合队列中的RNA-seq数据对PDAC和配对的正常样品进行了复杂的差异分析,旨在阐明差异表达的基因并通过基因本体论和潜在的生物学功能进行探索。京都基因与基因组百科全书富集分析。此外,构建了蛋白质-蛋白质相互作用网络,并从中鉴定出五个枢纽基因。此外,生存分析表明,轮毂基因与PDAC的预后明显相关。本研究可能会提供新的见解,以了解PDAC发病机理,并确定毂基因可能作为诊断和治疗的潜在目标。
   本研究包括7例行原发肿瘤根治性切除术的患者,所有患者均经术后病理证实为胰腺低分化腺癌。收集PDAC组织及其相邻的正常组织用于转录组测序分析,并在手术后立即保存在RNA稍后溶液中,并在提取RNA之前保存在–80°C。该研究已得到河南省人民医院伦理委员会的批准,所有患者均在手术前签署了知情同意书。按照制造商的说明,使用TRIzol试剂分离每个标本的总RNA。使用Agilent2100RNANano6000分析试剂盒对总RNA的完整性和浓度进行鉴定。后来,所有标本都被送往BGI公司,通过BGISEQ-500测序仪进行进一步的RNA-seq检测和分析。
   使用R脚本筛选了来自生成数据的PDAC和非PDAC样本之间的DEG,仅使用log2FC的数据进行筛选。≥1且Q值≤0.05作为DEG留待进一步研究。为了揭示DEG的功能作用,确定使用RNA-seq获得的转录谱,并进行GO和KEGG富集分析。基于BGI的DR.TOM系统,分析DEGs的功能富集,重点研究了与这些基因相关的途径,这些途径在生物学过程,分子功能和细胞成分方面都得到了丰富。应用KEGG通路分析来确定DEG的重要通路。默认富集结果的超几何分布检验的阈值为0.05。
   提供用于说明PPI信息的在线工具,用于检索相互作用基因数据库。为了进一步探索这些DEG之间的潜在相互作用,胰腺癌治疗网将DEG映射到STRING,并且只有达到最低合计得分>0.4的交互才被设置为显着。随后,执行了插件MCODE以识别所构建网络的重要模块。此外,通过使用CyHscape的另一个插件cytoHubba基于PPI网络识别了关键基因。为了研究中枢基因的预后影响,在线服务器PROGgeneV2被用来对TCGA的数据进行生存分析。在公开可用的TCGA数据集中,PDAC样本分别通过百万分位数中位数值作为截止值分为枢纽基因高表达和低表达组。进行Cox回归分析以揭示PDAC中轮毂基因表达与预后之间的相关性,并使用logrank检验进行假设检验。与OS相关的基因需要进一步分析,包括Pearson相关分析以及通过GEPIAOnline工具分析肿瘤与正常组织之间的表达水平。一个p<0.05的值被认为具有统计学意义。按照标准程序,使用EZNA总RNA试剂盒I分离了7位患者标本的总RNA。随后使用PrimeScriptRT试剂盒合成互补DNA。在ABI7500TouchRealTimePCR检测系统上进行实时PCR,根据比较Ct方法确定筛选出的轮毂基因的mRNA表达水平。将GAPDH设置为标准化对照。
   通过RNA-seq进行的配对差异基因表达分析发现,在胰腺癌治疗网队列中的七个配对PDAC样本中发现126个基因差异表达。在DEG中,有82个是上调基因,有44个是下调基因。为了进一步阐明DEG在人PDAC中的功能,进行GO注释和KEGG途径富集分析。GO分析确定了51个显着丰富的术语,并结合与分子功能,生物过程和细胞成分相关的术语。BP的变化在细胞粘附,血液凝固,蛋白水解,角质化,细胞外基质组织方面显着丰富。对于CC而言,DEG主要涉及细胞外区域,细胞外空间,膜的整体组成,质膜,细胞外囊泡。此外,对于MF类,由DEG编码的蛋白质的主要功能是钙离子结合,肽酶活性,金属肽酶活性,细胞外基质结构成分,结构分子活性。使用Fisher精确检验对与获得的DEG相关的途径术语进行了显着性检验。找出具有明显富集的途径术语,并选择DEG进行途径类别分析。有趣的是,大多数富集的途径都与信号转导和特定类型的癌症相关途径相关,包括化学致癌作用,IL-17信号传导途径。此外,DEG还富含蛋白质的消化和吸收,药物代谢-细胞色素p450和细胞色素p450的异源生物代谢。
   这个网络由策展数据库和实验确定的交互所构成。涉及有关基因邻域,基因融合和基因共现的相互作用分析;和文本挖掘,共表达。借助String数据库可以直观地看到蛋白质的直接或间接功能相互作用。此外,由Cytoscape插件MCODE进行的聚类分析从整个网络中确定了四个功能模块,随后对这四个模块的基因进行的路径富集分析可以帮助理解潜在的生物功能,结果表明这些模块主要参与肿瘤发生,细胞粘附和能量代谢,并结合了细胞粘附分子,癌症,细胞途径周期,PPAR信号传导途径,雌激素信号传导途径,胆固醇代谢。CEACAM5,KRT6A,KRT6B,KRT7,KRT17被建议具有预后与PDAC相关性,患者的五个基因的高表达可具有在生存条件更坏的结果。进一步探讨mRNA表达水平与人类肿瘤样本之间的关系。CEACAM5,KRT6A,KRT6B,KRT7,KRT17在PDAC组织中显示出高表达水平,然后表达基因之间进行Pearson相关分析。证明CEACAM5与KRT7正相关;KRT7也正相关KRT6A,KRT6B,KRT17:KRT6A;KRT6B;KRT17。为了进一步验证RNA-seq数据的可靠性,使用qRT-PCR验证中枢基因在癌症和非癌性样品中的表达。其结果是,相对表达水平CEACAM5,KRT6A,KRT6B,KRT7,KRT17着地更高相比nonPDAC样品。该结果与RNA-seq分析一致。
   肿瘤发生是复杂的,通常在转录水平上伴随着多种遗传改变。胰腺癌的高死亡率使其成为全世界的公共卫生问题。许多临床医生无法进行早期诊断,这可能是由于缺乏对基因或蛋白质中特定生物标志物的鉴定所致。幸运的是,RNA-seq技术的出现为探索在mRNA水平上肿瘤形成的机制以及确定有效的分子治疗靶标提供可能性。生物信息学和高通量测序的结合产生大量的基因表达谱,可以对疾病的发生,进展和复发进行统计分析,在肿瘤分析中起着重要的作用。在当前的研究中,基于转录组分析鉴定126个DEG。GO和KEGG富集分析表明,DEG主要与细胞粘附,膜的组成成分,信号转导和化学致癌作用,IL-17信号通路相关。此外通过PROGgeneV2对PDAC和DEG之间潜在的预后关联进行综合分析。CEACAM5,KRT6A,KRT6B,KRT7,KRT17对PDAC患者潜在的预后价值。在PPI网络和模块分析进行进一步探讨功能子网络和CEACAM5,KRT6A,KRT6B,KRT7,KRT17代表网络中的核心枢纽基因。而且,这些基因不仅与PDAC相关,而且与信号转导途径相关。
   CEACAM5是糖基磷脂酰肌醇连接的免疫球蛋白超家族的关键成员,附着在细胞的质膜上。编码最广泛研究的肿瘤标记物-癌胚抗原的CEACAM5基因是臭名昭著的,因为它作为几种恶性肿瘤的肿瘤标记物在临床工作中起着至关重要的作用。作为细胞间粘附分子的编码蛋白在结合细胞-细胞识别,增殖,分化以及癌症侵袭和转移的多个过程中起着不可替代的作用。此外,它在形成组织结构和新血管形成中必不可少。CEACAM5的表达现已发现与PDAC患者的淋巴结状态有显着相关性。最终证明,CEACAM5的过表达将促进胰腺癌的进展,尤其是侵袭和转移。敲除CEACAM5基因可以有效抑制荷瘤小鼠的肿瘤增殖。远处转移是PDAC患者预后不良的重要标志。表达CEACAM5比在正常组织中,这可能有助于其侵袭高于PDAC组织,这是与以前的研究相一致。研究发现CEACAM5过表达之间的OS有显着差异其余的,这可能是预测PDAC患者预后不良的标志。
   角蛋白是上皮细胞的典型中间丝蛋白,显示出显着程度的分子多样性。作为上皮细胞的部分结构基础,角蛋白在上皮细胞和组织的机械稳定性和完整性中起关键作用,涉及细胞内信号通路。角蛋白在头发和皮肤细胞中大量表达,其在其他组织中的异常表达可能引起病理过程,涉及各种肿瘤的进展。广泛研究角蛋白在癌症发展中的作用与上皮来源的肿瘤有关,例如膀胱癌,肺癌,结肠直肠癌,尿路上皮癌和胃癌。在本文中重点介绍KRTA/6B,KRT7,KRT17在PDAC中的作用。KRT6属于II型中间丝蛋白,包括三种同种型。在人类乳腺导管的肌上皮细胞中可以检测到KRT6A。KRT6A/KRT6B蛋白已被阐明在各种癌症中发挥作用。KRT6的表达受人尿道上皮细胞中ERK1/2途径的激活的调节。据报道,KRT6与notch1的相互作用可能加剧肾细胞癌的侵袭。但是,KRT在PDAC中的作用尚不清楚。RNA测序数据表明,米KRT6A/米KRT6B在PDAChyperexpressed。基于所述生存分析,发现在第一次患者具有较高米KRT6A/米KRT6B表达表明短周期OS。因此,需要进一步的研究来详细研究该功能,它可能是胰腺癌的潜在生物标志物和新的治疗靶标。另外发现在肿瘤组织中KRT6A/B与KRT7/KRT17正相关。此外,它们在相邻的组织对应物中几乎不存在。
   胰腺癌治疗网在PDAC中对KRT7的认可与先前的发现一致。实际上,KRT7是一种中间丝蛋白,可以在简单的上皮细胞中选择性表达。在正常胰腺中,在导管中仅能检测到极少量的表达,但腺泡和内分泌细胞中却没有表达,被认为是肝胰导管树导管细胞的特征性标志物。已证明KRT7在胰腺癌组织中显着过表达,通过免疫组织化学分析常规检测编码蛋白,以诊断PDAC。KRT7也有研究者参与胰腺癌细胞的分化,并研究了KRT7启动子可用于体外或体内靶向PDAC细胞。AdK7Luc病毒入侵检测进一步证明,通过在腺病毒中掺入KRT7启动子片段可以提高癌症特异性。研究表明,KRT7在胰腺癌中的过度表达与肝转移显着相关,建议将其作为区分Vater腺癌的胰腺和壶腹的标志物。KRT7已在癌症研究中进行广泛探索,但是,尚无任何研究将KRT7的表达与胰腺癌预后不良。胰腺癌治疗网的生存分析显示首次患者有高表达KRT7mRNA的享受比低表达的一个短显著OS和基因呈正相关KRT6A,KRT6B和KRT17分别。
   KRT17属于I型中间丝,主要参与基底上皮细胞的形成。然而,令人惊讶的是,KRT17在人体组织样本中被常规再生并高表达。成熟的胰腺导管上皮细胞不表达或几乎不表达KRT17,但是,与正常分化的胰腺组织相比,已确定PDAC样品中KRT17mRNA的水平明显上调,与正常胰腺相比,在肿瘤细胞中也发现了相同的趋势。细胞。此外,免疫组化分析表明,KRT17与邻近的非癌组织相比,其在肿瘤组织中过表达。由于KRT17是组织的结构成分,因此据报道,KRT17作为多功能启动子和致癌基因,在加速恶性肿瘤的增殖,转移和侵袭中起着关键作用。通过慢病毒介导的短发夹RNA沉默KRT17,可以复制对PANC-1人胰腺癌细胞增殖的抑制作用。并且发现,KRT17的上调通过EMT促进了PDAC细胞的增殖,侵袭和转移。此外,一些研究引起人们的担忧,即KRT17mRNA的过表达与PDAC患者预后不良有关。在研究中RNA-seq分析表明,与邻近的正常组织相比,KRT17的mRNA表达在癌组织中显着增加。生物信息学分析预测过度表达与肿瘤转移和预后不良有关,表明KRT17可以作为潜在的预后生物标志物和PDAC的治疗靶标。
   综上所述,通过采用RNA-seq方法鉴定PDAC患者中的126个DEG,并确定潜在的新型治疗靶点,并通过生物信息学分析评估其在PDAC患者中的预后价值。GO术语和KEGG途径分析丰富细胞成分,细胞过程相关的GO术语,信号转导以及与KEGG途径相关的特定类型的癌症。CEACAM5,KRT6A,KRT6B,KRT7,KRT17可以作为PDAC不良存活的新颖的生物标志物,和CEACAM5,KRT6A/乙,KRT17甚至可能发挥致癌作用,可能在PDAC治疗中提供有效的抗癌靶标。当然,研究存在局限性,因为TCGA数据库无法为胰腺癌治疗网提供足够的信息来区分非PDAC和非PDAC中分化较差的PDAC,因此使用所有胰腺癌亚型的样本进行公认的中枢基因的生存分析。因此,尽管该结果有助于理解毂基因的生物学相关性,但仍需要进一步的研究来验证毂基因的功能。在这项工作中,在低分化胰腺腺癌与匹配的正常组织之间鉴定出126个DEG。在DEG中,有五个基因被认为是中枢基因,它们与肿瘤进展的许多途径有关并导致不良预后。这项研究的结果可能为PDAC提供新颖的生物标志物,这对于进一步的研究是有价值的。

 
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  由著名肿瘤医学家、首届“国之名医—卓越建树奖”获得者夏廷毅教授担任医学总顾问;著名放射肿瘤物理学家、中国肿瘤放疗事业特殊贡献奖获得者张红志教授担任物理技术总顾问,领率国家一大批肿瘤放疗专家和物理师组建专业团队,聚焦精准放疗,整合多学科资源,通过专家下沉基层开展医疗技术服务,助推肿瘤精准放射医学产、学、研、用全链条一体化发展,全面提高全国各地肿瘤病人精准放疗可及性和综合治疗水平,最大限度满足肿瘤患者就地就近享受高水准、高质量人性化诊疗服务。
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