胰腺癌
 
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生物标志物在胰腺癌中的作用

  胰腺癌是一种高度致死性疾病,尽管进行不断的研究,但在过去的四十年中,研究结果仅略微改善患者的预后,但总体死亡率却有轻微的变化。胰腺癌是与癌症相关的死亡的第四大原因,2010年美国报告了36800例与胰腺癌相关的死亡,占所有癌症死亡的6.5%。类似的总体意见是从西方世界的其他地方报道。手术切除的胰腺癌与改善的预后相关,尤其是如果在早期就获得了诊断。遗憾的是,大多数症状,包括例如严重的体重减轻,腹痛,新发的2型糖尿病,黄疸和恶心,通常是模糊的并且在疾病过程中晚期发生。仅有20%的胰腺癌患者可以进行潜在的根治性切除术。缺乏用于人群筛查的有效肿瘤标志物。当前用于胰腺癌的标志物,特别是癌胚抗原和癌抗原19-9,缺乏适当的敏感性和特异性。需要用于以更定制的方式进行胰腺癌的治疗评估,残留癌或复发癌的检测甚至是靶向治疗的生物标志物。因此,胰腺癌中生物标志物的鉴定对于改善预后至关重要。蛋白质组学技术的发展增加对胰腺癌中生物标志物临床应用的兴趣。然而,对于胰腺癌的临床应用,具有良好敏感性和特异性的合适生物标志物的鉴定一直很少。在本文中,我们重点研究可能用于胰腺癌的基于蛋白质组的生物标志物,有望为该领域的进一步研究指明方向。
   胰腺癌组织是蛋白质组学生物标志物用于癌症检测的最直接来源,因为它可能具有最高浓度的癌症特异性标志物。但是,有两个主要原因使它无法用于癌症筛查。用于筛选的侵入性活检材料通常不易获得,而经皮活检甚至可能导致癌细胞播种。当可获得胰腺癌组织时,病理评估可做出最终诊断,并且是最佳选择。从胰腺癌组织获得的正在进行的生物标志物研究不仅用于诊断目的,而且还用于开发潜在的未来靶向疗法。通过MALDI-TOF-MS将胰腺癌组织与正常胰腺组织进行比较时,发现癌症患者galectin-3和钙调蛋白的水平高3倍。Galectin-3是B-半乳糖苷结合动物凝集素家族的一员,已发现有助于诊断例如甲状腺癌,但在肝癌,胃癌和舌癌中也有上调作用。在同一个家庭,半乳凝素也被识别为潜在的生物标志物。S100A11是一种钙结合蛋白,是S100蛋白家族的一个成员,在细胞核和细胞质中表达。S100蛋白调节许多细胞过程,例如细胞生长,细胞周期,分化,转录和分泌。据报道,S100蛋白在乳腺癌和甲状腺癌等各种癌症中过表达。其它研究已显示在胰腺癌S100A6,S100A8,S100A9和S100A10的上调。使用激光捕获显微切割术和2-DE分析胰腺癌基质成分中的蛋白质表达,已证明在肿瘤相关基质中存在高水平的S100A8和S100A9,而在良性或恶性上皮中则没有。
   免疫组化证实在特定的基质细胞,将其后来鉴定为单核细胞或巨噬细胞的未成熟。在这些细胞的子集中,S100A8和S100A9共表达,并且这种关系似乎受到相应肿瘤细胞的Smad4状态的影响。这项研究为复杂的肿瘤-基质相互作用提供了进一步的证据,并证明基质组织可以成为一种新颖且高度有前途的生物标志物来源。胰腺癌与大量形成的慢性胰腺炎之间的鉴别诊断在临床上具有挑战性。对癌症组织,慢性胰腺炎和正常胰腺进行包含900多种一抗的大规模免疫印迹分析。发现总共30种蛋白质在慢性胰腺炎和正常胰腺之间差异表达,而102种蛋白质在胰腺癌和正常胰腺之间差异。几种蛋白质,例如UHRF1,ATP7A和AOX1,在慢性胰腺炎和胰腺癌之间的表达有所不同,表明它们在胰腺癌发生中的重要性。这些蛋白质的组合可成为在手术或治疗前获得的内窥镜超声引导下的细针抽吸标本的有用诊断工具。胰腺癌会经历从良性到完全恶性的胰腺上皮内瘤变病变的多个阶段。通过提供有关患者处于哪个阶段的知识,胰腺癌病理可能对诊断和治疗有所帮助。尽管研究表明在不同阶段存在不同的遗传变异,例如早期PanIN-1A/B的K-ras,中间PanIN的p16-2和p53在PanIN-3晚期阶段,生物学机制仍在很大程度上尚不清楚。原因之一是由于缺乏合适的组织标本,难以研究胰腺癌的早期分子变化,因为处于早期阶段的患者通常没有现存的症状,因此无法获得组织样本。
   在遗传缺陷小鼠模型和早期胰腺癌细胞系中,PanINs和PDAC中的Plectin-1已被上调。Plectin-1是一种500kDa的大蛋白,与丝状肌动蛋白,微管和中间丝相关。发现Plectin-1仅与线粒体相关,因此可能提供了该细胞器与中间丝系统的重要联系。Plectin-1还可以结合特定的肽,当与磁荧光纳米颗粒偶联时,可能有助于检测前体病变和PDAC。通过2-DE已经鉴定胰腺癌组织在不同阶段的蛋白质组变化。从总共31种已鉴定的非冗余蛋白中选择了5种候选蛋白生物标记,包括14-3-3sigma,主要穹顶蛋白,前梯度2和膜联蛋白A4。AGR2在肿瘤发展的早期就增加,并且也存在于胰腺汁中。MVP表达,与PI3K途径相关联,并且被发现14-3-3Sigma在PANIN-2中增加,且-3。另一方面,膜联蛋白A4被下调。AnnexinA4是Ca2+-和磷脂结合蛋白,如膜联蛋白A2,以前在PDAC中已有报道。为了降低在胰腺组织样品中发现的蛋白质的复杂性和较大的动态范围,已使用质谱技术进行亚细胞分级分离来鉴定与胰腺癌相关的潜在生物标志物。在正常和胰腺癌组织中鉴定出2393种独特的蛋白质,并确定104种在胰腺癌中有显着变化的蛋白质。四种分泌和上调的蛋白已被证实可作为诊断胰腺癌,双链蛋白聚糖,色素上皮衍生因子,血小板反应蛋白2和转化生长因子B诱导的蛋白Ig-h3前体的潜在生物标志物,尽管这些标志物的敏感性和特异性数据尚不可用。
   关于淋巴结转移的信息对于制定手术策略以及决定其他其他治疗方法非常重要。胰腺癌组织与相应患者在基于抗体捕获的蛋白质组芯片上从相同患者获得的相应非癌性正常组织的蛋白质组比较,确定凝溶胶蛋白为检测胰腺癌淋巴结转移的候选生物标志物。凝溶胶蛋白是重要的肌动蛋白结合蛋白,在维持组织化的肌动蛋白细胞骨架中起主要作用。据报道,与淋巴结阴性胰腺癌相比,凝溶胶蛋白在伴淋巴结受累的胰腺导管腺癌中的表达显着增加。体内流体中的生物标志物血清和血浆血液是生物标记物最常使用的来源,具有最小的侵入性,易于获取,通常廉价且可重现以获取和分析。但是,某些高度丰富的蛋白质可能会影响较不丰富但对于诊断有价值的蛋白质的检测。一项研究旨在从胰腺癌患者和对照的319个血清样品中鉴定生物标志物。使用SELDI-TOFMS技术,鉴定出21个峰在胰腺癌和疾病控制之间有差异表达,18个峰在胰腺癌和健康志愿者之间。载脂蛋白CI和载脂蛋白A-II分别显着增加和减少。ApoC-I在控制血浆脂质代谢中起重要作用,并在胃癌,乳腺癌和胰腺癌中表达。ApoA-II存在于脂质颗粒的表面,可能在前列腺癌中起诊断作用。ApoA-II,ApoC-I和CA19-9曲线下的受体工作特征区域大于单独的CA19-9,胰腺癌vsDC,胰腺癌vsHVvs0.90,结果得到其他人的支持。
   CXCL-7是血管生成ELRbCXC趋化因子家族的趋化因子成员,在巨核细胞谱系中表达。使用新颖的空心组合基于纤维膜的低分子量蛋白质富集和基于LC-MS的定量shot弹蛋白质组学确定CXCL-7衍生的肽在胰腺癌患者中显着降低。这些作者比较一个小样本人群的血浆蛋白质组,获得53009个MS峰。然后,他们进一步证明CXCL-7在发现一个独立的盲队列使用高密度反相蛋白质微阵列。与CXCL-7的组合可将CA19-9的AUC值显着提高至0.961。但是,在这项研究中,尚不清楚解释胰腺癌患者CXCL-7减少的确切分子机制。血小板因子4是CXC趋化因子家族的另一个成员,存在于所有哺乳动物血小板的a颗粒以及肥大细胞的颗粒中。基于MALDI-TOF-MS的80个样品的临床血清谱分析已将PF4鉴定为胰腺癌的潜在标志物。通过ELISA技术对40个血清样品进行的验证显示,用于区分健康对照和胰腺癌的PF4浓度的AUC为0.833。胰腺癌和急性胰腺炎患者的区分度为0.829。
   蛋白质磷酸化是修饰生物系统的最常见方法之一。与对照组相比,胰腺癌患者血清中的几种磷蛋白水平显着增加。通过使用Bio-Plex悬浮液阵列,在胰腺癌患者的血清中发现六种候选磷蛋白。p-ERK1/2,p-MEK1,磷酸化-p90核糖体S6激酶,磷酸化-cAMP反应元件结合蛋白,p-Akt和p-IkB-a。这些磷蛋白与Ras/Raf/MEK/ERK信号通路相关,后者是胰腺癌中主要的促进生长的通路。来自同一研究的进一步数据显示,磷酸化和总ERK1/2的同时增加与胰腺癌患者呈正相关。在检测胰腺癌中,p-ERK1/2和CA19-9的组合可潜在避免假阴性并提高鉴别能力。热激蛋白27是一种功能强大的分子伴侣,可以防止新生和应激诱导的错误折叠蛋白聚集。已通过蛋白质芯片技术和2-DE在胰腺癌患者血清中鉴定出HSP27。与正常组织相比,发现HSP27在胰腺癌中表达上调,在检测胰腺癌中具有100%的敏感性和84%的特异性,并进一步被认为在吉西他滨耐药中起重要作用。
   胰液胰腺汁富含直接从胰腺导管癌细胞分泌的蛋白质,因此应该构成检测胰腺癌的特定蛋白质生物标志物的理想来源。然而,胰腺汁并不容易获得,此外,为了获得胰腺汁,内窥镜逆行胰胆管造影术本身可能会诱发4%-7%的急性胰腺炎。迄今为止,已在人胰液中鉴定出约170种蛋白质,其中三分之一是酶。当通过差异凝胶电泳和串联质谱法比较9例PDAC患者和9例健康志愿者的胰液时,鉴定出三种潜在的生物标志物:基质金属蛋白酶9,癌基因DJ1和a-1B-糖蛋白前体。DJ-1是参与Ras信号传导途径中的有丝分裂原依赖性蛋白质,据报道,在血清胰腺癌患者中增加。A1BG是免疫球蛋白超家族的一种分泌血浆蛋白,在胰腺癌组织标本的86.3%的恶性上皮细胞质中也有所增加。主胰管阻塞可能会改变胰液的蛋白质组成。比较患有胰腺癌的患者和患有胰腺良性疾病的患者的胰液的2-DE谱,发现阻断汁液分泌会强烈影响蛋白质组成。随后对具有类似胰管阻塞的患者进行分析。
   鉴定为lithostathineIa的异构体形式是在胰腺癌中持续减少的五个蛋白质斑点之一。使用稳定同位素标记和MS/MS进行定量蛋白质组学分析,以鉴定在PanIN-3患者的胰液中升高的蛋白质异常。在20种不同表达的蛋白中,PanIN-3果汁样品中的前梯度2显着增加。AGR2是一种分泌蛋白,在许多癌症中过表达,并且会影响胰腺癌细胞的增殖和侵袭。进一步的分析表明,有AGR267%的敏感性和90%的特异性在胰液样品中预测PANIN-3。蛋白质组学还可用于区分胰腺癌和胰腺炎。在通过同位素编码亲和标签和质谱对胰腺癌和胰腺炎进行的比较研究中,在胰液中鉴定出72种可变蛋白。某些鉴定出的蛋白质,包括纤维蛋白原B链,纤维蛋白溶酶原,神经细胞粘附分子L1和降钙素,在胰腺汁液中的丰度至少变化2倍。另外,胰腺癌的9种蛋白质均被上调。胰腺炎和胰腺癌患者。运甲状腺素蛋白被鉴定为胰腺液中潜在的蛋白质生物标志物,可用于检测胰腺癌。使用2-DE和MALDI-TOF-MS,与慢性胰腺炎和胆总管结石相比,胰腺癌中胰液中的TTR增加了两倍以上。然而,TTR仅存在于胰岛细胞中,而在胰腺癌细胞中不表达,这与其他人的报道一致。尿液是生物标志物的潜在来源,因为它很容易且无创地获得。然而,尿液的局限性在于可能感兴趣的蛋白质的稀释。其次,尿液来自肾脏,仅通过血液与胰腺“接触”,大多数蛋白质组信息存在于循环血液中。使用蛋白质组学技术,在胰腺癌患者的尿液样本中检测到多种失调的蛋白,提示尿液可能是胰腺癌生物标志物的有价值来源。
   从总共127个统计有效和差异表达的蛋白斑点中鉴定出5个潜在的蛋白质生物标记物,在其他研究中已报道其中大多数与胰腺癌有关。细胞系中的生物标志物细胞系是最容易获得的蛋白质组来源。这样可以分析分泌的蛋白质。使用从细胞系获得的数据时,最相关的限制是它可能无法代表临床环境中的主要组织样本。因此,很少有研究使用细胞系来鉴定胰腺癌的相关生物标志物。通过分析Panc-1胰腺癌细胞和永生化的非肿瘤HPDE细胞之间的分泌蛋白,鉴定出145种差异分泌蛋白。几种蛋白质已通过免疫组织化学验证,例如CD9,Perlecan,载脂蛋白E和纤连蛋白受体。CD9是在人类血小板表面表达的膜蛋白。CD9在许多细胞功能中发挥作用,例如粘附,迁移,信号转导和分化。Perlecan作为碱性成纤维细胞生长因子的受体参与血管生成和生长。ApoE是脂蛋白的蛋白质成分,在胰腺癌中具有抗肿瘤活性。
   纤连蛋白受体是整联蛋白家族的另一个成员。转移的发展,作为胰腺癌进展的一部分,显然涉及许多重要的蛋白质。蛋白质组学研究比较原发性和转移性PDAC细胞系可以揭示功能性蛋白,这些蛋白有助于预测转移和针对此过程的潜在疗法。为此,研究一种转移性PDAC细胞系AsPC-1和一种主要PDAC细胞系BxPC-3。使用SDS-PAGE和LC-MS/MS,分别从AsPC-1和BxPC-3细胞中鉴定出221和208种蛋白质,两种细胞系中均存在109种蛋白质。对其他蛋白质的分析显示两种细胞系中的不同水平,包括连环蛋白,钙黏着蛋白,整联蛋白,半乳糖凝集素,膜联蛋白和胶原蛋白。钙黏着蛋白是一类1型跨膜蛋白,它依赖于钙离子并与连环蛋白结合形成复合物来介导细胞黏附。它们均在原发性肿瘤细胞中发现,但在转移性肿瘤细胞中未发现,表明转移性AsPC-1细胞的细胞粘附缺陷。整联蛋白是形成异二聚体受体的糖蛋白成员。仅在BxPC-3细胞中鉴定出代表主要粘附分子的整联蛋白a2和a5。相反,半乳糖凝集素细胞膜上的糖结合蛋白和细胞外糖蛋白是仅在AsPC-1中发现的。这些蛋白质中的大多数在肿瘤细胞粘附和运动中起作用。使用Springbio抗体微阵列检测胰腺癌细胞SW1990和SW1990HM之间的不同蛋白质。选择胰高血糖素升高和泌乳素降低作为从40种可复制的,改变的蛋白质中检测癌症的潜在生物标志物。
   胰高血糖素诱导葡萄糖产生并调节碳水化合物和蛋白质代谢。催乳素是垂体释放的一种激素,对女性乳房发育和产奶有影响。两者都位于质膜上,并且可以影响肿瘤细胞的粘附。未来方面与其他类型的癌症相比,胰腺癌可能是遗传变异水平最高,导致大量蛋白质异常表达的实体瘤之一。具有高灵敏度和特异性的适当组合的蛋白质组生物标志物组可能比单个生物标志物更好。许多研究者使用相结合的生物标志物的方法和结果,到目前为止已经获得兴趣集中在胰腺癌检测蛋白质质谱分析。此外,一些研究还研究胰腺癌干细胞的差异表达蛋白,其中越来越多的证据表明其在肿瘤发生,生长和转移形成中起重要作用。靶向和消除胰腺癌干细胞可以显着改善胰腺切除术后胰腺癌患者的预后并避免复发。
   由于胰腺癌的特征,通常具有模糊的症状,但具有相关的肿瘤侵袭性,对标准疗法的抵抗力和不良的预后,因此鉴别敏感和特异性生物标志物至关重要。这样的生物标志物对于早期阶段的疾病检测将具有极高的价值。迄今为止,尽管已报道了新技术的发展和潜在标记物,但在临床情况中可能只有有限数量的潜在用途。然而,胰腺癌生物标志物的研究非常深入,蛋白质组学技术的使用可能会提供一种全新的工具,并可能提供潜在的改善,实现早期诊断,靶向治疗以及发现胰腺癌患者复发的可能性。

 
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  由著名肿瘤医学家、首届“国之名医—卓越建树奖”获得者夏廷毅教授担任医学总顾问;著名放射肿瘤物理学家、中国肿瘤放疗事业特殊贡献奖获得者张红志教授担任物理技术总顾问,领率国家一大批肿瘤放疗专家和物理师组建专业团队,聚焦精准放疗,整合多学科资源,通过专家下沉基层开展医疗技术服务,助推肿瘤精准放射医学产、学、研、用全链条一体化发展,全面提高全国各地肿瘤病人精准放疗可及性和综合治疗水平,最大限度满足肿瘤患者就地就近享受高水准、高质量人性化诊疗服务。
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