胰腺癌是全世界消化系统最常见的恶性肿瘤之一，在过去的几十年中，其发病率有所增加。它是世界上第四大癌症死因，其5年相对存活率目前为8％。所述的高死亡率是由它的侵略性的生物学性质，晚期症状发作引起的，并且缺乏的特定处理。因此，有必要更多地了解PC在分子水平，并确定新的潜在治疗靶点的抗癌药物。近年来，随着抗癌药物研究的普遍兴起，草药引起广泛的关注。大量研究表明，许多具有抗肿瘤作用的草药可以分为几种化合物，包括异东方素。异荭草素是黄酮，它是一种化学类黄酮类化合物，和木犀草素的6-C-葡糖苷。生物测定指导的分级分离技术导致了分离出作为东方龙胆中主要降血糖成分的异Orientientin。团队证实了木犀草素在PC中具有很强的抗癌作用。需要确定木犀草素的6-C-葡萄糖苷异Orientinin对癌症的作用。具有许多生物学活性和治疗作用，包括抗炎，抗糖尿病，抗氧化剂，促凋亡和自噬诱导作用，关注托姆刀的胰腺癌治疗网相信异Orientinin具有治疗炎性和赘生性疾病的潜力。因此，研究异Orientinin是否对PC及其潜在机制具有潜在的抗肿瘤作用。
　　 AMP激活的蛋白激酶是细胞能量状态的一种传感器，可以在所有类型的真核生物中找到，甚至在非常原始的真核生物中也可以找到，例如贾第鞭毛虫。AMPK是异源三聚体复合物，包括催化性a亚基和调节性B和y亚基。每个亚基都有2-3种类型；因此，至少有12种AMPK。在特定情况下，AMPK似乎具有不同的抑制肿瘤或促进肿瘤的能力。AMPK激活剂，如二甲双胍，苯乙双胍和5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖核苷酸，对许多癌症。已经注意到，活化的AMPK通过诱导凋亡来抑制细胞增殖并杀死癌细胞。此外，AMPK是诱导上皮-间质转化所必需的，这是导致癌症转移的重要过程。此外，二甲双胍可以通过激活AMPK来逆转人乳腺癌细胞的多药耐药性。尽管已经研究AMPK在癌症中的机制的几个方面，但尚未完全阐明AMPK在PC中的病理生理作用。在这项研究中，目的是探索异Orientinin对PC的医学益处及其与AMPK的关系，并且关注托姆刀的胰腺癌治疗网的研究重点在于其对人PC细胞系PANC-1的细胞增殖，凋亡，细胞迁移和侵袭的影响。
　　 人PC细胞系PANC-1细胞是从中国科学院的细胞库中获得的，人PC细胞PATU-8988是由美国典型培养物保藏中心。PANC-1用DMEM培养，PATU-8988用RPMI-1640在5％CO2的37°C下培养。两种培养基均包含100U/mL青霉素，10％FBS和100ug/mL链霉素，每2天更换一次。当细胞汇合至80％左右时，将细胞用0.25％胰蛋白酶–0.02％乙二胺四乙酸分离，以进行传代培养或进行以下实验处理。将PANC-1和PATU-8988细胞接种到6厘米的培养皿中。当细胞达到70％–90％汇合时，将异Orientinin加入无FBS的培养基中24小时。然后，准备细胞用于后续实验，例如提取蛋白，分离RNA和transwell入侵测定。
　　 含有PRKAA1的短发夹RNA的慢病毒载体是由GeneChem设计和生产的。首先，将PANC-1和PATU-8988细胞接种在六孔板中，并使其生长直至接近30％–40％汇合。丢弃培养基后，将六孔板用磷酸盐缓冲盐水洗涤3次。然后，将每个板装满慢病毒转染增强溶液和10ug/mL聚乙烯。在37°C和5％CO2的温育和转染8–12小时后，关注托姆刀的胰腺癌治疗网将转染培养基替换为普通培养基。当细胞达到板的80％时，收获细胞用于传代或实验。在上面提到的所有操作中，都使用适当的生物危害安全设备对细胞进行了处理。将PANC-1和PATU-8988细胞接种到96孔板上。每个孔包含约5,000个细胞和200uL含10％FBS的培养基。当每个孔的细胞达到70％汇合时，更换培养基，并添加具有不同浓度的Orientientin的无FBS培养基。24小时后，将细胞用PBS洗涤一次，弃去含有异Orientinin的培养基，并添加100uL不含FBS的培养基和10uLCellCountingKit8试剂。将细胞在37°C下再孵育1-2小时，并根据制造商的说明使用ELISA读数器在490nm处检测每个孔的吸光度。细胞活力表示为吸光度的倍数变化。
　　 将细胞铺在6cm培养皿中，并用异定向蛋白处理24小时。根据制造商的说明书，使用膜联蛋白V-FITC/PI凋亡检测试剂盒测量细胞凋亡率。处理后，使用BDAccuriC6测量荧光强度。如前所述处理细胞后，根据制造商的说明通过添加TRIzol分离总RNA。然后，使用RevertAid第一链cDNA合成试剂盒从RNA中获得cDNA。接下来，在7500Real-TimePCR系统中使用SYBRGreenMasterMix执行定量实时-PCR。B-肌动蛋白被扩增为内标。使用ΔC进行定量RT-PCR数据的分析值。处理后，将细胞在含有10％磷酸酶抑制剂和1％苯基甲基磺酰氟的放射免疫沉淀测定缓冲液中裂解30分钟。然后，将细胞裂解液以12,000×g离心，并收集上清液。使用BCA蛋白质测定试剂盒测量每组的蛋白质浓度。变性后，将每组50ug的蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转移到PVDF膜上，并与特异性抗体在4°C下孵育过夜。使用获自ThermoFisherScientific的增强型化学发光试剂进行蛋白质检测，并使用AlphaEaseFC软件可视化免疫复合物。
　　 适当处理细胞后，收集培养基。通过ELISA试剂盒根据制造商的说明书直接测量培养基中涉及的VEGF蛋白。在450nm处测量吸光度。用VEGF标准曲线校准VEGF的浓度。根据制造商的协议，将带有8um孔膜过滤器的Transwell插入物用于迁移和侵袭分析。简而言之，将Matrigel地下室膜基质放在上部隔室中，以测试侵袭性，而不是迁移性。将体积为500–600uLRPMI-1640或DMEM以及10％FBS作为化学引诱剂添加到下部隔室中。将细胞在无FBS的培养基中饥饿过夜后，细胞将其置于上部隔室中并孵育24小时。然后，关注托姆刀的胰腺癌治疗网用棉签轻轻擦洗上表面的细胞，用PBS清洗滤膜3次，然后用4％多聚甲醛固定细胞20分钟。随后，将细胞用0.05％的结晶紫溶液染色，然后用PBS洗涤3次。然后，使插入物在室温下干燥，并在倒置显微镜下拍摄膜的照片。使用SPSS19.0软件分析数据。结果表示为至少三个独立实验的平均值±SEM。当P<0.05时，差异被认为具有统计学意义。
　　 在研究开始时，关注托姆刀的胰腺癌治疗网进行了CCK8分析，以评估异Orientinin是否会影响PANC-1和PATU-8988细胞的细胞活力。两种细胞系均在异取向素存在下生长24小时，然后添加CCK8溶液。在20、40、80和160uM的浓度下，细胞活力显着下降。然后，关注托姆刀的胰腺癌治疗网在shRNA干扰组中进行CCK8分析。在PANC-1和PATU-8988细胞系中，异Orientin处理组的细胞增殖与未处理组的细胞增殖没有显着差异。将细胞用异Orientorin培养24小时后，关注托姆刀的胰腺癌治疗网评估了其表达Western印迹检测p-AMPK和AMPK的表达。异Orientin处理后，p-AMPK表达增加。然后，在shRNA组中，关注托姆刀的胰腺癌治疗网选择80uM的浓度来检测isoorientin的作用。shRNA组中的AMPK和p-AMPK的表达水平比野生型PC细胞和用阴性对照慢病毒转染的组中的AMPK和p-AMPK的表达水平低得多。在shRNA组中，接受或不接受isoorientin治疗的情况下，AMPK和p-AMPK的表达没有差异。
　　 由于AMPK与多种癌细胞中细胞凋亡的调节相关，因此在长达24小时的时间里分析异Orientin处理对PANC-1和PATU-8988细胞凋亡率的影响。除了在有或没有异Orientinin的情况下培养的细胞外，所有细胞均以相同的方式处理。正常PC组中异Orientin诱导的细胞凋亡反应增加。相反，在有或没有异Orientinin处理的shRNA组中，凋亡没有显着差异。因此，可以得出结论，通过激活AMPK信号通路增加异Orientinin的促凋亡反应。由于VEGF，MMP和EMT与肿瘤的存活，运动，迁移和侵袭以及恶性肿瘤的变化有关，因此关注托姆刀的胰腺癌治疗网评估异Orientinin是否能够调节VEGF，MMP和EMT的表达。将细胞用异取向素处理24小时，VEGF，EMT标志和MMP标志的表达为通过实时PCR分析和Western印迹进行评估。关注托姆刀的胰腺癌治疗网还通过ELISA测试了培养基中释放的VEGF水平。发现用异Orientinin处理的PC细胞具有显着降低的VEGF，N-钙黏着蛋白，MMP2和MMP9的表达水平以及E-钙黏着蛋白在mRNA和蛋白上的表达水平级别。同时，在shRNA组中，未观察到这些变化。
　　 为了进一步评估异Orientinin对PC细胞迁移和侵袭的影响，关注托姆刀的胰腺癌治疗网利用了Transwell迁移/侵袭实验。在存在或不存在异orientinin的情况下，将细胞接种到transwell系统的上室中24小时。用结晶紫核染料将细胞染色后，获得了迁移到transwell膜下表面的细胞的显微照片。与未处理的对照相比，被异染色素处理的组中紫色染色的迁移细胞的密度明显降低。在shRNA组中，经异Orientinin处理的组与未处理的组之间没有发现显着差异。PC被认为是最具侵入性的肿瘤疾病之一，其预后很差。除非出现新的化学疗法，放射疗法和生物疗法，否则死亡率不会显着降低。据报道，AMPK是肿瘤治疗的潜在治疗靶标。AMPK是一种普遍存在且高度保守的细胞能量状态传感器，它通过磷酸化参与葡萄糖，蛋白质和脂质代谢的各种酶来调节细胞能量稳态。据报道，通过抑制细胞增殖和迁移，诱导细胞死亡以及逆转EMT来衡量，增加甲状腺乳头状癌细胞系中AMPK的激活会导致明显的抗肿瘤反应。此外，癌细胞接触新型AMPK激活剂OSU-53足以逆转这些细胞中的EMT。其他几种AMPK激活剂，如二甲双胍，苯乙双胍和AICAR，已被证明可调节多种癌症类型的细胞存活和转移。草药已成为搜索的抗肿瘤药物的热点话题。许多研究指出，具有抗肿瘤作用的各种草药可以分为几种化合物，包括异东方素。类黄酮，如黄ical苷，槲皮素，木犀草素和表没食子儿茶素，已被证明可以激活AMPK信号通路。在这里假设，异黄酮作为一种黄酮，可以通过AMPK信号通路诱导癌细胞死亡并降低恶性肿瘤。在这项研究中，选择PANC-1和PATU-8988细胞系来测试isoorientin的抗肿瘤能力。发现异Orientinin可以至少部分地通过激活AMPK信号通路来降低PC细胞的恶性程度，进一步证明异Orientinin作为PC的新治疗剂的潜力。
　　 细胞凋亡在细胞增殖，分化，衰老和死亡的过程中起着至关重要的作用。先前的研究得出结论，BCL-2和BAX控制程序性细胞死亡。因此，关注托姆刀的胰腺癌治疗网测定异Orientin处理后BCL-2和BAX的水平，发现异Orientin有效抑制BCL-2的表达，而BAX的表达却呈现相反的趋势。为了进一步检查异Orientinin的凋亡作用，关注托姆刀的胰腺癌治疗网通过流式细胞仪检查了细胞凋亡率。在某种程度上，癌细胞恶性的生物学行为是侵袭性和高血管生成。EMT是一个生物学过程，其中上皮细胞转化为具有间充质表型的特殊细胞，并且可以在癌症转移过程中分离这些细胞。先前的研究发现，EMT的变化通常伴随着MMPs表达的增加。因此，确定E-钙粘蛋白，N-钙粘蛋白，MMP2和MMP9的异荭草素处理后的水平，发现异荭草素efficaciously抑制N-钙粘蛋白，MMP2和MMP9的表达，而E-钙粘蛋白的水平增加了。EMT和细胞外基质的降解使癌细胞迁移成为可能。进行transwell侵袭和迁移分析，以进一步验证isoorientin对体外癌细胞侵袭性的抑制作用。VEGF是最有效的促血管生成生长因子之一。VEGF的抑制可以抑制体内肿瘤的生长。此外，VEGF可以促进肿瘤细胞的迁移和侵袭能力，从而导致肿瘤细胞恶性程度的增加。在关注托姆刀的胰腺癌治疗网的实验中，在PC细胞系中，无论是在mRNA还是在蛋白质水平，通过异Orientinin处理，VEGF均显着降低。所有数据表明，异Orientinin可以降低PC的恶性程度。更重要的是，在这项研究中，关注托姆刀的胰腺癌治疗网观察到AMPK的磷酸化伴随着E-钙粘蛋白的上调和VEGF，N-钙粘蛋白和MMP的下调，这与细胞凋亡相似。这表明异Orientinin通过AMPK信号通路的激活降低恶性肿瘤并诱导PC细胞凋亡。
　　 尽管在关注托姆刀的胰腺癌治疗网的实验中测试了AMPK的抗肿瘤作用，但本文并未完全证明AMPK调节细胞凋亡，迁移和侵袭的具体机制。在许多报告中，已经证实由AMPK负调控的mTOR与癌细胞死亡有关。同样地，肿瘤抑制TSC2和p53是AMPK活性的下游靶标。有趣的是，对现有文献的调查表明，AMPK的激活是诱导EMT的必要条件，但不是充分条件。总之，可以肯定的是异Orientinin与AMPK的抗肿瘤作用之间的关系以及它们与其他信号通路的关系非常复杂，需要进一步研究。总而言之，关注托姆刀的胰腺癌治疗网的研究表明，异Orientinin可以通过AMPK信号通路抑制VEGF，VEGF，N-钙黏着蛋白，MMP2，MMP9和BAX的表达，并促进E-钙黏着蛋白和BCL-2的表达。它为异黄酮作为抗癌药提供新的功能。关注托姆刀的胰腺癌治疗网期望异东方素将是针对细胞凋亡，迁移，侵袭和血管生成的新治疗策略。